Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Гель агарозы в лотке, используемый для гель-электрофореза

Агароза - это полисахарид , обычно получаемый из некоторых красных морских водорослей . [1] Это линейный полимер, состоящий из повторяющейся единицы агаробиозы, которая представляет собой дисахарид, состоящий из D- галактозы и 3,6-ангидро- L -галактопиранозы. [2] Агароза является одним из двух основных компонентов агара и очищается от агара путем удаления другого компонента агара, агаропектина . [3]

Агароза часто используется в молекулярной биологии для разделения больших молекул, особенно ДНК , электрофорезом . Пластинки агарозного геля (обычно 0,7–2%) для электрофореза легко приготовить путем заливки теплого жидкого раствора в форму. Для этой цели коммерчески доступен широкий спектр различных агароз с разной молекулярной массой и различными свойствами. Агарозу можно также формовать в шарики и использовать в ряде хроматографических методов очистки белка .

Структура [ править ]

Структура повторяющегося звена полимера агарозы.

Агарозном представляет собой линейный полимер с молекулярной массой около 120000, состоящий из чередующихся D - галактозы и 3,6-anhydro- л -galactopyranose связаны альфа- (1 → 3) и β- (1 → 4) гликозидных связей. 3,6-ангидро- L -галактопираноза представляет собой L- галактозу с ангидромостиком между положениями 3 и 6, хотя некоторые звенья L- галактозы в полимере могут не содержать мостик. Некоторые звенья D- галактозы и L- галактозы могут быть метилированы , а пируват и сульфат также обнаруживаются в небольших количествах. [4]

Каждая цепь агарозы содержит ~ 800 молекул галактозы, а полимерные цепи агарозы образуют спиральные волокна, которые объединяются в сверхспиральную структуру с радиусом 20-30  нм . [5] Волокна квазижесткие и имеют широкий диапазон длины в зависимости от концентрации агарозы. [6] После затвердевания волокна образуют трехмерную сетку каналов диаметром от 50 нм до> 200 нм в зависимости от концентрации используемой агарозы - более высокие концентрации приводят к более низкому среднему диаметру пор. Трехмерная структура удерживается вместе водородными связями и поэтому может быть разрушена путем нагревания до жидкого состояния.

Свойства [ править ]

Агароза доступна в виде белого порошка, который растворяется в воде, близкой к кипению, и образует гель при охлаждении. Агароза демонстрирует явление термического гистерезиса при переходе от жидкости к гелю, то есть она гелеобразует и плавится при разных температурах. Температура гелеобразования и плавления варьируется в зависимости от типа агарозы. Стандартные агарозы, полученные из гелидиума, имеют температуру гелеобразования 34–38 ° C (93–100 ° F) и температуру плавления 90–95 ° C (194–203 ° F), а агарозы , полученные из Gracilaria , из-за более высокой метокси заместители, имеет температуру гелеобразования 40–52 ° C (104–126 ° F) и температуру плавления 85–90 ° C (185–194 ° F). [7]Температура плавления и гелеобразования может зависеть от концентрации геля, особенно при низкой концентрации геля менее 1%. Поэтому температуры гелеобразования и плавления даны для определенной концентрации агарозы.

Природная агароза содержит незаряженные метильные группы, и степень метилирования прямо пропорциональна температуре гелеобразования. Однако синтетическое метилирование имеет обратный эффект, в результате чего повышенное метилирование снижает температуру гелеобразования. [8] Различные химически модифицированные агарозы с различными температурами плавления и гелеобразования доступны посредством химических модификаций.

Агароза в геле образует сетку, которая содержит поры, и размер пор зависит от концентрации добавленной агарозы. При стоянии агарозные гели склонны к синерезису (вытеснению воды через поверхность геля), но этот процесс идет достаточно медленно, чтобы не мешать использованию геля. [9] [10]

Гель агарозы может иметь высокую прочность геля при низкой концентрации, что делает его пригодным в качестве антиконвекционной среды для гель-электрофореза . Гели агарозы, разбавленные до 0,15%, могут образовывать пластины для гель-электрофореза. [11] Полимер агарозы содержит заряженные группы, в частности пируват и сульфат . [8] Эти отрицательно заряженные группы могут замедлять движение молекул ДНК в процессе, называемом электроэндосмосом (ЭЭО), поэтому агароза с низким ЭЭО обычно предпочтительна для использования в электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозном геле.. Также доступны агарозы с нулевым EEO, но они могут быть нежелательными для некоторых применений, поскольку они могут быть получены путем добавления положительно заряженных групп, которые могут повлиять на последующие ферментативные реакции. [12] Электроэндосмос является причиной предпочтительного использования агарозы перед агаром, поскольку агаропектин в агаре содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп. Удаление агаропектина в агарозе существенно снижает EEO, а также снижает неспецифическую адсорбцию биомолекул на гелевой матрице. Однако для некоторых применений, таких как электрофорез сывороточного белка, может быть желательным высокий EEO, и в используемый гель можно добавлять агаропектин. [13]

Агарозы с низкой температурой плавления и гелеобразования [ править ]

Температуры плавления и гелеобразования агарозы могут быть изменены химическими модификациями, чаще всего гидроксиэтилированием, которое уменьшает количество внутрицепочечных водородных связей, что приводит к более низким температурам плавления и схватывания, чем у стандартных агароз. [14] Точная температура определяется степенью замещения, и многие доступные агарозы с низкой температурой плавления (LMP) могут оставаться жидкими при температуре 30–35 ° C (86–95 ° F). Это свойство позволяет ферментативноманипуляции, проводимые непосредственно после гель-электрофореза ДНК путем добавления срезов расплавленного геля, содержащего интересующий фрагмент ДНК, к реакционной смеси. Агароза LMP содержит меньше сульфатов, которые могут влиять на некоторые ферментативные реакции, и поэтому ее предпочтительно использовать для некоторых приложений. Гидроксиэтилирование может уменьшить размер пор за счет уменьшения плотности упаковки агарозных пучков, поэтому гель LMP также может влиять на время и разделение во время электрофореза. [15] Агарозы со сверхнизкой температурой плавления или гелеобразования могут образовывать гель только при 8–15 ° C (46–59 ° F).

Приложения [ править ]

Агарозный гель с полосами ДНК, окрашенными бромидом этидия и визуализированными в УФ-свете на УФ-трансиллюминаторе.

Агароза является предпочтительной матрицей для работы с белками и нуклеиновыми кислотами, поскольку она имеет широкий спектр физической, химической и термической стабильности, а ее более низкая степень химической сложности также снижает вероятность ее взаимодействия с биомолекулами . Агароза чаще всего используется в качестве среды для электрофоретического разделения в аналитическом масштабе при электрофорезе в агарозном геле . Гели, изготовленные из очищенной агарозы, имеют относительно большой размер пор, что делает их полезными для разделения больших молекул, таких как белки и белковые комплексы> 200 килодальтон, а также фрагменты ДНК> 100 пар оснований. Агароза также широко используется для ряда других применений, например, для иммунодиффузии ииммуноэлектрофорез , поскольку волокна агарозы функционируют как якорь для иммунокомплексов .

Электрофорез в агарозном геле [ править ]

Основная статья: Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле является рутинным методом разделения ДНК в лаборатории. Гели агарозы имеют более низкую разрешающую способность для ДНК, чем гели акриламида, но они имеют больший диапазон разделения и поэтому обычно используются для фрагментов ДНК длиной 50–20 000 пар оснований , хотя разрешение более 6 МБ возможно при импульсном режиме. полевой гель-электрофорез (ПФГЭ). [16] Его также можно использовать для разделения больших белковых молекул, и он является предпочтительной матрицей для гель-электрофореза частиц с эффективным радиусом более 5-10 нм. [11]

Размер пор геля влияет на размер просеиваемой ДНК. Чем ниже концентрация геля, тем больше размер пор и тем больше ДНК, которую можно просеять. Однако гели с низкой концентрацией (0,1–0,2%) хрупкие и поэтому их трудно обрабатывать, а электрофорез больших молекул ДНК может занять несколько дней. Предел разрешения для стандартного электрофореза в агарозном геле составляет около 750 т.п.н. [16] Этот предел может быть преодолен с помощью PFGE, когда к гелю прикладываются переменные ортогональные электрические поля. Фрагменты ДНК переориентируются при изменении направления приложенного поля, но более крупным молекулам ДНК требуется больше времени, чтобы перестроиться при изменении электрического поля, а для более мелких - быстрее, и поэтому ДНК можно фракционировать по размеру.

Гели агарозы отливают в форму и, когда они застывают, обычно работают горизонтально, погруженные в буферный раствор. Трис-ацетат-ЭДТА и Трис-борат-ЭДТА буферы обычно используются, но и другие буферы , такие как трис-фосфата, барбитуровой кислоты барбитурата натрия или трис- барбитуратов буферов могут быть использованы в других приложениях. [1] ДНК обычно визуализируется окрашиванием бромистым этидием, а затем рассматривается в УФ-свете , но доступны и другие методы окрашивания, такие как SYBR Green , GelRed , метиленовый синий и кристаллический фиолетовый.. Если разделенные фрагменты ДНК необходимы для дальнейшего последующего эксперимента, их можно вырезать из геля на кусочки для дальнейших манипуляций.

Колонки для гель-фильтрации на основе агарозы, используемые для очистки белка на аппарате AKTA FPLC .

Очистка белков [ править ]

Матрица из агарозного геля часто используется для очистки белка , например, при препаративном разделении на колонках, например, в гель-фильтрационной хроматографии , аффинной хроматографии и ионообменной хроматографии . Однако он не используется в виде непрерывного геля, а скорее формируется в виде пористых шариков или смол различной степени измельчения. [17] Гранулы очень пористые, поэтому белок может свободно проходить через них. Эти шарики на основе агарозы, как правило, мягкие и легко измельчаются, поэтому их следует использовать в условиях гравитационного потока, низкоскоростного центрифугирования или при низком давлении. [18]Прочность смол может быть улучшена за счет увеличения сшивки и химического твердения агарозных смол, однако такие изменения могут также привести к снижению связывающей способности для белка в некоторых процедурах разделения, таких как аффинная хроматография .

Агароза является полезным материалом для хроматографии, потому что она не абсорбирует биомолекулы в какой-либо значительной степени, имеет хорошие свойства текучести и может выдерживать экстремальные значения pH и ионной силы, а также высокую концентрацию денатурирующих агентов, таких как 8M мочевина или 6M гуанидин HCl . [19] Примерами матрицы на основе агарозы для гель-фильтрационной хроматографии являются Сефароза и WorkBeads 40 SEC (поперечно- сшитая агароза из гранул ), Praesto и Superose (высокосшитые гранулы агарозы) и Superdex ( декстран, ковалентно связанный с агарозой).

Для аффинной хроматографии агароза в виде гранул является наиболее часто используемой матричной смолой для присоединения лигандов, связывающих белок. [20] Лиганды ковалентно связаны через спейсер с активированными гидроксильными группами полимера в виде гранул агарозы. Затем представляющие интерес белки могут быть выборочно связаны с лигандами, чтобы отделить их от других белков, после чего их можно элюировать. Используемые гранулы агарозы обычно имеют плотность 4% и 6% с высокой способностью связывания белка.

Твердые питательные среды [ править ]

Иногда вместо агара для культивирования организмов можно использовать чашку с агарозой, поскольку агар может содержать примеси, которые могут повлиять на рост организма или некоторые последующие процедуры, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Агароза также тверже, чем агар, и поэтому может быть предпочтительнее там, где необходима большая прочность геля, а ее более низкая температура гелеобразования может предотвратить возникновение теплового шока в организме, когда клетки суспендированы в жидкости перед гелеобразованием. Он может быть использован для культуры строгих автотрофных бактерий, растений протопласта , [21] Caenorhabditis Элеганс , [22] других организмов и различных клеточных линий.

3D-культура клеток [ править ]

Агароза часто используется в качестве основы для трехмерной культуры клеток человека и животных . Поскольку агароза образует нецитотоксические гидрогели , ее можно использовать для воспроизведения естественной среды клеток человеческого тела, внеклеточного матрикса . Однако агароза образует жесткий инертный гидрогель , который не несет никакой биологической информации, поэтому клетки человека и животных не могут прикрепляться к полисахариду . Из-за этих специфических свойств гидрогель агарозы имитирует естественную среду хрящевых клеток и, как было показано, поддерживает дифференцировку хондроцитов в хрящ.. Чтобы изменить механические свойства агарозы для воспроизведения естественной среды других человеческих клеток, агароза может быть химически модифицирована путем точного окисления первичного спирта D- галактозы в карбоновую кислоту . Эта химическая модификация обеспечивает новый класс материалов, называемых карбоксилированной агарозой. За счет контроля количества карбоксилированной D-галактозы в основной цепи полисахарида можно точно контролировать механические свойства получаемого гидрогеля. Эти карбоксилированные гидрогели агарозы затем могут быть ковалентно связаны с пептидами.образовывать гидрогель, на котором могут прилипать клетки. Эти карбоксилированные гидрогели агарозы, как было показано, направляют организацию эндотелиальных клеток человека в поляризованные просветы. [23] Смешивание полностью карбоксилированной агарозы с природной агарозой может быть использовано для получения гидрогелей, обладающих целым рядом механических свойств. [24] [25]

Тесты подвижности [ править ]

Иногда вместо агара для измерения подвижности и подвижности микроорганизмов используют агарозу. Подвижные виды смогут, хотя и медленно, мигрировать через пористый гель, и тогда можно будет визуализировать скорость инфильтрации. Пористость геля непосредственно связана с концентрацией агара или агарозы в среде, так что различные гели концентрации могут быть использованы для оценки ячейки плавание , роятся , скользя и подергивание моторики. Анализ миграции клеток под агарозой можно использовать для измерения хемотаксиса и хемокинеза. Слой агарозного геля помещают между популяцией клеток и хемоаттрактантом . Поскольку градиент концентрации возникает из-за диффузии хемоаттрактанта в гель, различные популяции клеток, требующие различных уровней стимуляции для миграции, затем могут быть визуализированы с течением времени с помощью микрофотографии, когда они туннелируют вверх через гель против силы тяжести по градиенту.

См. Также [ править ]

  • Агар
  • SDD-AGE

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б Джеппсон, Джо; CB Laurell; Би Франзен (1979). «Электрофорез в агарозном геле» . Клиническая химия . 25 (4): 629–638. DOI : 10.1093 / clinchem / 25.4.629 . PMID  313856 .
  2. ↑ Агар. Архивировано 16 октября 2007 г., в Wayback Machine на lsbu.ac.uk Water Structure and Science.
  3. ^ «Агар» . Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций .
  4. ↑ Рафаэль Армисен; Фернандо Галатас. «Глава 1 - Производство, свойства и использование агара» . Fao.org.
  5. ^ Том Маниатис; EF Fritsch; Джозеф Сэмбрук (1982). «Глава 5, протокол 1». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 . п. 5.4. ISBN 978-0879691363.
  6. ^ Алистер М. Стивен; Глин О. Филлипс, ред. (2006). Пищевые полисахариды и их применение . CRC Press. п. 226. ISBN. 978-0824759223.
  7. ^ Семинар по биотехнологии морских водорослей: Сводный отчет . Национальная академия прессы. 1986. стр. 25.
  8. ^ a b «Приложение B: Физическая химия агарозы» (PDF) . Lonza Group .
  9. ^ SE Hill; Дэвид А. Ледвард; JR Митчелл, ред. (1998). Функциональные свойства макромолекул пищевых продуктов . Springer. п. 149. ISBN 978-0-7514-0421-0.
  10. ^ Парк Хэсун; Кинам Парк; Валид С.В. Шалаби (1993). Биоразлагаемые гидрогели для доставки лекарств . CRC Press. п. 102. ISBN 978-1566760041.
  11. ^ а б Филип Сервер (1983). «Агарозные гели: свойства и применение для электрофореза». Электрофорез . 4 (6): 375–382. DOI : 10.1002 / elps.1150040602 . S2CID 97819634 . 
  12. ^ Иосиф Sambrook; Дэвид Рассел. «Глава 5, протокол 1». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 (3-е изд.). п. 5.7. ISBN 978-0-87969-577-4.
  13. ↑ Керен, Дэвид (26 сентября 2003 г.). Белковый электрофорез в клинической диагностике . CRC Press. С. 7–8. ISBN 978-0340812136.
  14. ^ Том Маниатис; EF Fritsch; Джозеф Сэмбрук. «Глава 5, протокол 6». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 . п. 5.29. ISBN 978-0879695774.
  15. ↑ Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH (20 апреля 2012 г.). «Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК» . J Vis Exp . 62 (62): 3923. DOI : 10,3791 / 3923 . PMC 4846332 . PMID 22546956 .  
  16. ^ a b Том Маниатис; EF Fritsch; Джозеф Сэмбрук (1982). «Глава 5, протокол 1». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 . п. 5.2–5.3. ISBN 978-0879691363.
  17. ^ Дэвид Freifelder (1982). Физическая биохимия: приложения к биохимии и молекулярной биологии (2-е изд.). WH Freeman. п. 240. ISBN 978-0716714446.
  18. ^ «Обзор очищения сродства» . Thermo Scientific .
  19. ^ Дэвид Freifelder (1982). Физическая биохимия: приложения к биохимии и молекулярной биологии (2-е изд.). WH Freeman. п. 258. ISBN 978-0716714446.
  20. ^ Педро Куатрекасас; Меир Вильчек (2004). Уильям Дж. Леннарц; М. Дэниэл Лейн (ред.). Энциклопедия биологической химии . Том 1. Академическая пресса. п. 52. ISBN 9780124437104.
  21. ^ JM Bonga; Патрик фон Адеркас (1992). Культура деревьев in vitro . Springer. п. 16. ISBN 978-0792315407.
  22. ^ Гай А. Колдуэлл; Шелли Н. Уильямс; Ким А. Колдуэлл (2006). Интегрированная геномика: лабораторный курс на основе открытий . Вайли. С. 94–95. ISBN 978-0470095027.
  23. ^ А. Забудьте; Дж. Кристенсен; С. Людеке; Э. Колер; С. Тобиас; М. Матлоуби; Р. Томанн; В. П. Шастри (2013). «Полисахаридные гидрогели с регулируемой жесткостью и проваскулогенными свойствами посредством переключения α-спирали на β-лист во вторичной структуре» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (32): 12887–12892. Bibcode : 2013PNAS..11012887F . DOI : 10.1073 / pnas.1222880110 . PMC 3740890 . PMID 23886665 .  
  24. ^ А. Забудьте; Р.А. Пике; В. Ахамади; С. Людеке; В.П. Шастри (2015). «Механически адаптированные гидрогели агарозы путем молекулярного легирования полисахаридами бета-листа». Макромолекулярные быстрые коммуникации . 36 (2): 196–203. DOI : 10.1002 / marc.201400353 . PMID 25250523 . 
  25. ^ А. Рютер; А. Забудьте; А. Рой; К. Карбальо; Ф. Мисмер; РК Дукор; LA Nafie; К. Йоханнесен; В.П. Шастри; С. Людеке (2017). «раскрытие прямой роли бета-цепей полисахаридов в структуре физических гидрогелей высшего порядка». Angewandte Chemie International Edition . 56 (16): 1–6. DOI : 10.1002 / anie.201701019 . ЛВП : 10067/1417890151162165141 . PMID 28334501 .