Юго- западный блот - это лабораторный метод, который включает идентификацию, а также характеристику ДНК-связывающих белков [1] по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами. Определение молекулярной массы из белков , связывающихся с ДНК также стало возможным с помощью техники. Название происходит от комбинации идей, лежащих в основе методов Саузерн-блоттинга и Вестерн-блоттинга , с помощью которых они обнаруживают ДНК и белок соответственно. Подобно другим типам блоттинга, белки разделяются с помощью SDS-PAGE и впоследствии переносятся на нитроцеллюлозу.мембраны. После этого юго-западный блоттинг начинает меняться в зависимости от процедуры, поскольку с момента первого блоттинга было предложено и обнаружено гораздо больше с целью улучшения результатов. Прежним протоколам мешали необходимость в больших количествах белков и их склонность к деградации при изоляции.
Юго-западный блоттинг был впервые описан Брайаном Боуэном, Джеем Стейнбергом, Лэммли из Великобритании и Гарольдом Вайнтраубом в 1979 году. [2] В то время этот метод первоначально назывался «белковый блоттинг». Хотя существовали методы очистки белков, связанных с ДНК, их часто приходилось использовать вместе для получения желаемых результатов. Таким образом, Боуэн и его коллеги стремились описать процедуру, которая могла бы упростить текущие методы их времени.
Метод
Оригинальный метод
Для начала, представляющие интерес белки готовят для метода SDS-PAGE и затем загружают в гель для разделения на основе размера молекулы. Большие белки будут испытывать трудности с перемещением через сетчатую структуру геля, поскольку они не могут проходить через поры с такой легкостью, как более мелкие белки. В результате крупные белки не перемещаются по гелю очень далеко по сравнению с более мелкими белками, которые перемещаются дальше. По прошествии достаточного времени это приводит к появлению отдельных полос, которые можно визуализировать с помощью ряда процедур окрашивания после гель-электрофореза. Полосы находятся в разных положениях на геле относительно лунки, в которую они были загружены.
Затем белки должны быть ренатурированы, после чего гель подвергается прессованию между двумя нитроцеллюлозными фильтрами, которые за счет диффузии переносят белки из геля на мембранные фильтры. На данный момент созданы копии геля, каждый из которых служит определенной цели. Один мембранный фильтр можно окрашивать, чтобы увидеть полосы белка, которые были созданы в результате гель-электрофореза, а другой используется в фактическом процессе гибридизации с подготовленными 32 P радиоактивно меченными специфическими олигонуклеотидными зондами. [3] Для обнаружения любых взаимодействий белок-ДНК обычно используется авторадиография .
Юго-западное блот-картирование
«Юго-западное блот-картирование» - это эффективный по времени способ идентификации ДНК-связывающих белков и конкретных участков геномной ДНК, с которыми они взаимодействуют.
- Во-первых, белки готовят из смеси, которая подвергает их воздействию денатурирующего агента додецилсульфата натрия (SDS). Это воздействие не только преобразует белки из свернутой конформации в развернутую конформацию, но также устанавливает между ними однородный заряд, а также способствует легкости разделения по размеру с использованием полиакриламидного геля ( PAGE ).
- Во-вторых, в отличие от предыдущего шага, белки на полученном геле должны быть ренатурированы путем удаления SDS. Это помогает вернуть белкам форму, которая в идеале максимизирует взаимодействие на более поздних этапах процедуры.
- В-третьих, блоттинг происходит на нитроцеллюлозных мембранах с использованием методов и свойств диффузии.
- В-четвертых, переходя к созданию зонда, выбираются определенные рестрикционные ферменты и используются в исследуемой области ДНК для получения фрагментов подходящего, но разного размера.
- В-пятых, фрагменты метят радиоактивно, и им дается подходящее время для связывания с заранее приготовленными блотами. По истечении этого времени блоты промывают, чтобы удалить всю ДНК, которая не могла связываться.
- Наконец, специфически связанную ДНК элюируют из каждого индивидуального комплекса белок-ДНК и анализируют с помощью другого применения электрофореза в полиакриламидном геле. [4]
Полученные результаты
Есть надежда, что по прошествии времени для связывания с олигонуклеотидными зондами некоторые белки на мембранном фильтре связались с зондами. Любой зонд, который не смог связать белок, необходимо удалить. После удаления несвязанного зонда, чтобы лучше визуализировать мембранный фильтр, его подвергают дополнительным различным процедурам. Соответствуя полученному мембранному фильтру второму мембранному фильтру, между которым был зажат гель, положение белка по сравнению с лестницей молекулярной массы дает информацию о массе белка, связанного с зондом.
Модификации метода
- Вместо того, чтобы полагаться на стандартную диффузию для переноса белков из геля в фильтр, обычно используется электроблоттинг , поскольку он удаляет денатурирующий агент , SDS, тем самым позволяя белкам ренатурировать по мере их движения к фильтру. [3]
- Обезжиренное молоко добавляется в фильтр перед гибридизацией с зондами, поскольку оно содержит альбумин бычьей сыворотки (БСА), который предотвращает любые нежелательные или слабые взаимодействия ДНК с нитроцеллюлозной мембраной. [2]
- Быстрый анализ защиты от диметилсульфата (DMS) можно использовать для идентификации неспецифического связывания по сравнению со специфическим связыванием на блотах. [5]
- Во время стадии гибридизации ДНК-зонда определенные количества соли используются для усиления специфических взаимодействий, которые происходят между ДНК и белками.
Преимущества, недостатки, потенциал
Преимущества
- Учитывая способность юго-западного блоттинга изучать сродство белков к связыванию с ДНК, эту информацию можно в дальнейшем использовать для выявления специфических белковых факторов, которые также связываются с ДНК. Эти белковые факторы могут участвовать в контроле экспрессии генов.
- В отличие от сдвига электрофоретической подвижности и отпечатка стопы ДНК, может происходить определение молекулярной массы неизвестных белков, которые связываются с ДНК. [3]
- Боуэн и его коллеги не только экспериментировали и продемонстрировали процедуру обнаружения ДНК-связывающих белков, но также процедуры для РНК-связывающих белков, а также гистон-связывающих белков. [2]
- Результаты могут быть объединены с масс-спектрометрией, чтобы помочь в идентификации ДНК-связывающих белков. [6]
- Определение изоэлектрической точки возможно за счет использования 2D-SDS-PAGE вместо стандартного одномерного измерения. [6]
Недостатки
- Так как метод включает использование SDS-PAGE, который использует эффект, который додецилсульфат натрия оказывает на белки, который заключается в их денатурировании, существует возможность диссоциации белковых факторов, которые обладают множеством субъединиц в процессе. [3] Это может повлиять на то, насколько хорошо белковый фактор связывается с ДНК на более поздних этапах этого метода.
- Не все белки ренатурируют в процессе переноса на нитроцеллюлозные мембраны после разделения с помощью SDS-PAGE. В этой области ренатурации белков до сих пор ведутся эксперименты.
- Также проводятся эксперименты с возможностью повторного использования юго-западных блотов для тестирования белков с помощью различных ДНК-зондов перед утилизацией. Однако главная задача состоит в том, чтобы составить схему, описывающую условия, при которых можно удалить ранее использованные зонды из блота без затрат на денатурацию белков или их извлечение. [7]
Потенциал
- Преодоление проблемы повторного использования блотов может позволить использовать конкретный олигонуклеотидный зонд, в котором радиоактивное мечение варьируется для изучения степени связывания мутантов зонда с белками. [5]
- Олигонуклеотиды не могут проникать через гель SDS-PAGE для связывания с белками, что подчеркивает важность проведения стадии блоттинга. Однако в этом может не быть необходимости, если создаются гели «проницаемые для белков-олигонуклеотидов». С такими гелями представляющие интерес олигонуклеотидные зонды могут проникать в гели и связываться с белками, сводя к минимуму этапы метода, сохраняя результаты в одном месте. [5]
- Имеются данные о том, что тканеспецифические связывающие ДНК белки могут быть идентифицированы с помощью картографирования юго-западного блоттинга. Более того, их специфическое для последовательности связывание позволяет очистить соответствующие избирательно связанные фрагменты ДНК и может улучшить опосредованное белком клонирование регуляторных последовательностей ДНК. [4]
Рекомендации
- ^ Southwestern + Blot в Национальной медицинской библиотеке США по предметным заголовкам по медицинским предметам (MeSH)
- ^ a b c Боуэн, B; Steinberg, J; Лэммли, Великобритания; Вайнтрауб, H (1980-01-11). «Обнаружение ДНК-связывающих белков с помощью белкового блоттинга» . Исследования нуклеиновых кислот . 8 (1): 1–20. DOI : 10.1093 / nar / 8.1.1 . ISSN 0305-1048 . PMC 327239 . PMID 6243775 .
- ^ а б в г Сиу, Фрэнсис KY; Ли, Лео ТО; Чоу, Билли KC (2007-12-20). «Юго-западный блоттинг в исследовании регуляции транскрипции» . Протоколы природы . 3 (1): 51–58. DOI : 10.1038 / nprot.2007.492 . ISSN 1754-2189 . PMID 18193021 .
- ^ а б Лелонг, Жан-Клод; Прево, Грегуар; Ли, Кён Ир; Крепен, Мишель (июнь 1989 г.). «Саут-вестерн-блот-картирование: процедура для одновременной характеристики ДНК-связывающих белков и их конкретных участков-мишеней геномной ДНК» . Аналитическая биохимия . 179 (2): 299–303. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (89) 90132-2 . PMID 2774177 .
- ^ а б в Дей, Бипаша; Тукрал, Самир; Кришнан, Шрути; Чакробарти, Майнак; Гупта, Сахил; Мангани, Чанчал; Рани, Вибха (01.06.2012). «ДНК-белковые взаимодействия: методы обнаружения и анализа» . Молекулярная и клеточная биохимия . 365 (1): 279–299. DOI : 10.1007 / s11010-012-1269-Z . ISSN 1573-4919 . PMID 22399265 .
- ^ а б Цзя, Иньшань; Нагоре, Линда; Джарретт, Гарри (2015). «Юго-западный блоттинг» . ДНК-белковые взаимодействия . Методы молекулярной биологии (Клифтон, Нью-Джерси). 1334 . С. 85–99. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-2877-4_5 . ISBN 978-1-4939-2876-7. ISSN 1940-6029 . PMC 4887086 . PMID 26404144 .
- ^ Цзя, Иньшань; Цзян, Дайфэн; Джарретт, Гарри В. (ноябрь 2010 г.). «Повторное зондирование блотов Southwestern с использованием щелочной фосфатазы» . Журнал хроматографии A . 1217 (45): 7177–7181. DOI : 10.1016 / j.chroma.2010.09.033 . ISSN 0021-9673 . PMC 2964665 . PMID 20926088 .