Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Дорожка 1 является отрицательным контролем и содержит только генетический материал. Дорожка 2 содержит белок, а также фрагмент ДНК, который, исходя из своей последовательности, не взаимодействует. Дорожка 3 содержит белок и фрагмент ДНК, который действительно реагирует; Полученный комплекс больше, тяжелее и медленнее. Образец, показанный на дорожке 3, является тем, который был бы результатом, если бы вся ДНК была связана и во время электрофореза не происходило диссоциации комплекса. Когда эти условия не выполняются, на дорожке 3 можно увидеть вторую полосу, отражающую присутствие свободной ДНК или диссоциацию комплекса ДНК-белок.

Анализ электрофоретической подвижности сдвига (EMSA) или подвижность сдвиг электрофорез , также известный как анализ геля - сдвиг , анализ сдвига подвижности в геле , анализ сдвига полосы или анализ замедляющего геля , является общим электрофорез аффинности метода , используемый для исследования белок-ДНК или белки - РНК взаимодействия. Эта процедура может определить, способен ли белок или смесь белков связываться с данной последовательностью ДНК или РНК, и иногда может указывать на то, участвует ли более одной белковой молекулы в связывающем комплексе. Анализы сдвига геля часто проводят in vitro.одновременно с экспериментами по созданию отпечатков ДНК- азы , удлинению праймера и промотор-зонду при изучении инициации транскрипции , репликации группы ДНК, репарации ДНК или процессинга и созревания РНК, а также сплайсинга пре-мРНК. [1] Хотя прекурсоры можно найти в более ранней литературе, большинство современных анализов основаны на методах, описанных Гарнером и Ревзином [2] и Фридом и Кротерсом . [3]

Принцип [ править ]

Анализ сдвига подвижности - это электрофоретическое разделение смеси белок-ДНК или белок-РНК на полиакриламидном или агарозном геле в течение короткого периода (примерно 1,5-2 часа для геля размером 15-20 см). [4] Скорость, с которой различные молекулы (и их комбинации) перемещаются через гель, определяется их размером и зарядом и, в меньшей степени, их формой (см. Гель-электрофорез.). Контрольная дорожка (ДНК-зонд без белка) будет содержать единственную полосу, соответствующую несвязанному фрагменту ДНК или РНК. Однако, если предположить, что белок способен связываться с фрагментом, дорожка с белком, который связывается с присутствующим, будет содержать другую полосу, которая представляет более крупный, менее мобильный комплекс зонда нуклеиновой кислоты, связанный с белком, который «сдвинут» вверх на геле. (поскольку он двигался медленнее).

В правильных экспериментальных условиях взаимодействие между ДНК (или РНК) и белком стабилизируется, а соотношение связанных и несвязанных нуклеиновых кислот на геле отражает долю свободных и связанных молекул зонда по мере того, как реакция связывания входит в гель. Эта стабильность частично обусловлена ​​«эффектом клетки», заключающимся в том, что белок, окруженный гелевой матрицей, не может диффундировать от зонда до того, как они рекомбинируют. [5] Если известны исходные концентрации белка и зонда и известна стехиометрия комплекса, можно определить кажущееся сродство белка к последовательности нуклеиновой кислоты. [6]Если комплекс не является очень долгоживущим в условиях геля или не учитывается диссоциация во время электрофореза, полученное число является кажущимся Kd. Если концентрация белка неизвестна, но известна сложная стехиометрия, концентрацию белка можно определить, увеличивая концентрацию ДНК-зонда до тех пор, пока дальнейшие приращения не увеличат долю связанного белка. Путем сравнения с набором стандартных разведений свободного зонда, проведенного на том же геле, можно рассчитать количество молей белка. [4]

Варианты и дополнения [ править ]

К этой смеси можно добавить антитело, распознающее белок, чтобы создать еще больший комплекс с большим сдвигом. Этот метод называется анализом сверхсдвига и используется для однозначной идентификации белка, присутствующего в комплексе белок-нуклеиновая кислота.

Часто дополнительную дорожку проводят с олигонуклеотидом- конкурентом для определения наиболее подходящей связывающей последовательности для связывающего белка. Использование различных олигонуклеотидов с определенной последовательностью позволяет идентифицировать точный сайт связывания по конкуренции (не показано на диаграмме). Варианты конкурентного анализа полезны для измерения специфичности связывания и для измерения кинетики ассоциации и диссоциации. Таким образом, EMSA может также использоваться как часть эксперимента SELEX для отбора олигонуклеотидов, которые действительно связывают данный белок. [ необходима цитата ]

После определения связывания ДНК с белком in vitro ряд алгоритмов может сузить поиск по идентификации фактора транскрипции. Олигонуклеотиды консенсусной последовательности для интересующего фактора транскрипции будут способны конкурировать за связывание, устраняя сдвинутую полосу, и должны быть подтверждены суперсдвигом. Если предсказанная консенсусная последовательность не может конкурировать за связывание, идентификации фактора транскрипции может помочь Multiplexed Competitor EMSA (MC-EMSA), посредством чего большие наборы консенсусных последовательностей мультиплексируются в каждой реакции, и когда один набор конкурирует за связывание, отдельные консенсусные последовательности из этого набора запускаются в дальнейшей реакции. [7]

В целях визуализации фрагмент нуклеиновой кислоты обычно помечен радиоактивной , флуоресцентной или биотиновой меткой. Стандартное окрашивание бромидом этидия менее чувствительно, чем эти методы, и может не обладать чувствительностью для обнаружения нуклеиновой кислоты, если в этих экспериментах используются небольшие количества нуклеиновой кислоты или одноцепочечной нуклеиновой кислоты (кислот). При использовании биотиновой метки стрептавидин, конъюгированный с ферментом, таким как пероксидаза хрена, используется для обнаружения фрагмента ДНК. [8] [9]Хотя изотопное мечение ДНК оказывает незначительное влияние или не влияет на аффинность связывания с белком, использование неизотопных меток, включая флурофоры или биотин, может изменить аффинность и / или стехиометрию интересующего взаимодействия белков. Конкуренция между зондом, меченным флуорофором или биотином, и немеченой ДНК той же последовательности может быть использована для определения того, изменяет ли метка аффинность связывания или стехиометрию.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Гранадино В, Пеналва LO, зеленый МР, Valcarcel Дж, Санчес Л. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7343-8.
  2. ↑ Гарнер М.М., Ревзин А. (июль 1981 г.). «Метод гель-электрофореза для количественной оценки связывания белков с конкретными участками ДНК: применение к компонентам системы регуляции оперона лактозы Escherichia coli» . Nucleic Acids Res . 9 (13): 3047–60. DOI : 10.1093 / NAR / 9.13.3047 . PMC  327330 . PMID  6269071 .
  3. ↑ Fried M, Crothers DM (декабрь 1981 г.). «Равновесия и кинетика взаимодействий lac-репрессор-оператор при электрофорезе в полиакриламидном геле» . Nucleic Acids Res . 9 (23): 6505–25. DOI : 10.1093 / NAR / 9.23.6505 . PMC 327619 . PMID 6275366 .  
  4. ^ a b Осубель, Фредерик М. (1994). Текущие протоколы в молекулярной биологии . Чичестер: Джон Уайли и сыновья. С. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1.
  5. Перейти ↑ Fried MG, Liu G (1994). «Молекулярная секвестрация стабилизирует комплексы CAP-ДНК во время электрофореза в полиакриламидном геле» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (23): 5054–5059. DOI : 10.1093 / NAR / 22.23.5054 . PMC 523777 . PMID 7800499 .  
  6. Перейти ↑ Fried MG (1989). «Измерение параметров взаимодействия белок-ДНК с помощью анализа сдвига подвижности электрофореза». Электрофорез . 10 (5–6): 366–376. DOI : 10.1002 / elps.1150100515 . PMID 2670548 . S2CID 19372331 .  
  7. Перейти ↑ Smith AJ, Humphries SE (январь 2009 г.). «Характеристика ДНК-связывающих белков с использованием мультиплексированного конкурента EMSA». J. Mol. Биол . 385 (3): 714–7. DOI : 10.1016 / j.jmb.2008.11.035 . PMID 19059416 . 
  8. ^ Хеллман, Лэнс М; Фрид, Майкл G (2007). «Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для обнаружения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота» . Протоколы природы . 2 (8): 1849–1861. DOI : 10.1038 / nprot.2007.249 . ISSN 1754-2189 . PMC 2757439 . PMID 17703195 .   
  9. ^ Осмосенсинг и осмосигнализация . Академическая пресса. 1 октября 2007 г. С. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8.

Внешние ссылки [ править ]

  • Протокол сдвига хемилюминесцентного геля