Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Стрептавидин
Streptavidin.png
Мономерный стрептавидин (ленточная диаграмма) со связанным биотином (сферы); PDB : 1STP
Идентификаторы
ОрганизмStreptomyces avidinii
Символ?
UniProtP22629
Ищи
СтруктурыШвейцарская модель
ДоменыИнтерПро

Стрептавидин / ˌ с т р ɛ р т æ v ɪ д ɪ п / является 52,8 (тетрамер) кДа белок , очищенный от бактерии Streptomyces avidinii . Стрептавидин гомо-тетрамер имеют чрезвычайно высокое сродство к биотину (также известный как витамин В7 или витамин Н). При константе диссоциации (K d ) порядка ≈10 −14 моль / л [1]Связывание биотина со стрептавидином является одним из самых сильных нековалентных взаимодействий, известных в природе. Стрептавидин широко используется в молекулярной биологии и бионанотехнологии из-за устойчивости комплекса стрептавидин-биотин к органическим растворителям, денатурантам (например, хлорид гуанидиния ), детергентам (например, SDS , Triton X-100 ), протеолитическим ферментам и экстремальным температурам и pH.

Структура [ править ]

Тетрамерная структура стрептавидина с 2 связанными биотинами

Кристаллическая структура стрептавидина со связанным биотином была описана двумя группами в 1989 году. Структура была решена с использованием многочастотной аномальной дифракции Hendrickson et al. [2] в Колумбийском университете и с использованием множественной изоморфной замены Weber et al. [3] в Центральном отделе исследований и разработок EI DuPont. По состоянию на сентябрь 2017 года в банке данных Protein хранится 171 структура . См. Эту ссылкудля полного списка. N- и C-концы полноразмерного белка из 159 остатков процессируются с образованием более короткого «сердцевинного» стрептавидина, обычно состоящего из остатков 13–139; удаление N- и C-концов необходимо для наивысшего сродства связывания биотина. Вторичная структура мономера стрептавидина состоит из восьми антипараллельных β-цепей, которые складываются, образуя антипараллельную третичную структуру β-цилиндра . биотинсайт связывания расположен на одном конце каждого β-цилиндра. Четыре идентичных мономера стрептавидина (т.е. четыре идентичных β-барабанчика) связываются с образованием тетрамерной четвертичной структуры стрептавидина. Сайт связывания биотина в каждом цилиндре состоит из остатков изнутри цилиндра вместе с консервативным Trp120 из соседней субъединицы. Таким образом, каждая субъединица вносит свой вклад в сайт связывания на соседней субъединице, и поэтому тетрамер также можно рассматривать как димер функциональных димеров.

Истоки высокой близости [ править ]

Многочисленные кристаллические структуры комплекса стрептавидин-биотин пролили свет на происхождение замечательного сродства. Во-первых, существует высокая комплементарность формы связывающего кармана и биотина. Во-вторых, в сайте связывания с биотином образуется разветвленная сеть водородных связей. Есть восемь водородных связейнепосредственно связаны с остатками в сайте связывания (так называемая «первая оболочка» водородной связи), включая остатки Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 и Asp128. Существует также «вторая оболочка» водородных связей, включающая остатки, которые взаимодействуют с остатками первой оболочки. Однако сродство стрептавидина к биотину превышает то, которое можно было бы предсказать только на основе взаимодействий водородных связей, что предполагает другой механизм, способствующий высокому сродству. [4] Карман, связывающий биотин, является гидрофобным , и существуют многочисленные силы Ван-дер-Ваальса.-опосредованные контакты и гидрофобные взаимодействия с биотином, когда он находится в кармане, что также считается причиной высокого сродства. В частности, карман выстлан консервативными остатками триптофана. Наконец, связывание биотина сопровождается стабилизацией гибкой петли, соединяющей β-нити 3 и 4 (L3 / 4), которая закрывает связанный биотин, действуя как `` крышка '' над связывающим карманом и способствуя чрезвычайно медленному биотину. скорость диссоциации.

Большинство попыток мутации стрептавидина приводят к снижению аффинности связывания биотина, чего следует ожидать в такой высокооптимизированной системе. Однако было обнаружено, что недавно созданный мутант стрептавидина, названный траптавидином, имеет более чем в десять раз более медленную диссоциацию биотина в дополнение к более высокой термической и механической стабильности. [5] Это снижение скорости диссоциации сопровождалось двукратным уменьшением скорости ассоциации.

Аффинность связывания биотина может быть нарушена из-за химической маркировки стрептавидина, например, с помощью амино-реактивных флуорофоров . Флавидин представляет собой мутант стрептавидина без боковых цепей лизина, который сохраняет хорошие характеристики связывания биотина после такого мечения флуоресцентным красителем. [6]

Использование в биотехнологии [ править ]

Среди наиболее распространенных применений стрептавидина - очистка или обнаружение различных биомолекул. Сильное взаимодействие стрептавидин-биотин можно использовать для присоединения различных биомолекул друг к другу или на твердой основе. Чтобы нарушить взаимодействие стрептавидин-биотин, которое часто денатурирует очищаемый интересующий белок, необходимы суровые условия. Однако было показано, что короткая инкубация в воде при температуре выше 70 ° C обратимо нарушает взаимодействие (по крайней мере, для биотинилированной ДНК) без денатурации стрептавидина, что позволяет повторно использовать твердую подложку из стрептавидина. [7] Еще одним применением стрептавидина является очистка и обнаружение белков, генетически модифицированных пептидом Strep-tag . Стрептавидин широко используется при вестерн-блоттинге.и иммуноанализы, конъюгированные с некоторой репортерной молекулой, такой как пероксидаза хрена . Стрептавидин также использовался в развивающейся области нанобиотехнологии , использовании биологических молекул, таких как белки или липиды, для создания устройств / структур нанометрового масштаба . В этом контексте стрептавидин можно использовать в качестве строительного блока для связывания биотинилированных молекул ДНК с целью создания каркасов из однослойных углеродных нанотрубок [8] или даже сложных полиэдров ДНК. [9] Тетрамерный стрептавидин также использовался в качестве концентратора, вокруг которого могут быть расположены другие белки, либо с помощью аффинной метки, такой как Strep-tag или AviTag, либо путем генетического слияния сSpyTag . [10] Слияние со SpyTag позволило создать сборки с 8 или 20 субъединицами стрептавидина. А также в качестве молекулярного зонда силы для атомно - силовой микроскопии исследований, [11] новые материалы , такие как 3D - кристаллических решеток [12] также были созданы. Стрептавидин имеет умеренно кислую изоэлектрическую точку (pI) ~ 5, но коммерчески доступна рекомбинантная форма стрептавидина с близкой к нейтральной pI.

Предварительно нацеленная иммунотерапия

Предварительно прицельная иммунотерапия использует стрептавидин, конъюгированный с моноклональным антителом против антигенов раковых клеток, с последующей инъекцией радиоактивно меченного биотина для доставки излучения только к раковой клетке. Первоначальные препятствия включают насыщение сайтов связывания биотина на стрептавидине эндогенным биотином вместо введенного радиоактивно меченного биотина и высокую степень радиоактивного воздействия на почки из-за сильных адсорбционных свойств стрептавидина. В настоящее время считается, что этот высокий уровень связывания с прикрепленными типами клеток, такими как активированные тромбоциты и меланомы, является результатом связывания интегрина, опосредованного последовательностью RYD в стрептавидине. [13]

Варианты с контролируемым количеством сайтов привязки [ править ]

Моновалентные и мономерные
Схема сравнения моновалентного и мономерного стрептавидина

Стрептавидин представляет собой тетрамер, и каждая субъединица связывает биотин с равным сродством. Многовалентность является преимуществом в некоторых приложениях, например, когда эффекты авидности улучшают способность молекул, прикрепленных к стрептавидину, обнаруживать специфические Т-клетки. [14] В других случаях, таких как использование стрептавидина для визуализации определенных белков на клетках, поливалентность может нарушить функцию интересующего белка. Моновалентный стрептавидин представляет собой сконструированную рекомбинантную форму стрептавидина, которая представляет собой тетрамер, но только один из четырех сайтов связывания является функциональным. Этот единственный сайт связывания имеет сродство 10 -14 моль / л и не может вызывать перекрестное сшивание. [15] Применение моновалентного стрептавидина включает флуоресцентное отслеживание рецепторов на поверхности клетки., украшающие ДНК оригами и выступающие в качестве указателя для идентификации конкретных областей для криоэлектронной микроскопии .

Мономерный стрептавидин представляет собой рекомбинантную форму стрептавидина с мутациями для разрушения тетрамера на мономер и повышения растворимости полученной изолированной субъединицы. Варианты мономерного стрептавидина имеют сродство к биотину 10 -7 моль / л 10 -8 моль / л и поэтому не идеальны для этикетирования, но полезны для очистки, где желательна обратимость. [16] [17]

Двухвалентный
Срез белка, сравнивая ориентацию биотина в цис-двухвалентном и транс-двухвалентном стрептавидине.

Стрептавидин с точно двумя сайтами связывания биотина на тетрамер может быть получен путем смешивания субъединиц с функциональным сайтом связывания биотина и без него и очистки с помощью ионообменной хроматографии . Функциональные сайты связывания здесь обладают такой же стабильностью связывания биотина, что и стрептавидин дикого типа. Двухвалентный стрептавидин с двумя сайтами связывания биотина вместе (цис-двухвалентный) или отдельно (транс-двухвалентный) может быть очищен отдельно. [18]

Трехвалентный

Стрептавидин с точно тремя сайтами связывания биотина на тетрамер также может быть получен с использованием того же принципа, что и получение двухвалентных стрептавидинов. [19]

Стрептавидины с высокой валентностью

Стрептавидины более высокой валентности были получены с использованием химии конъюгации изопептидных связей с использованием технологии SpyTag / SpyCatcher . [20] Это включает тетрамер стрептавидина с тремя сайтами связывания биотина и мертвый стрептавидин, слитый либо со SpyTag, либо со SpyCatcher. Когда разные тетрамеры смешиваются вместе, происходит ковалентное связывание, позволяющее увеличить количество сайтов связывания биотина. С помощью этого метода были созданы шесть и двенадцать сайтов связывания биотина на молекулу.

Сравнение с авидином [ править ]

Стрептавидин - не единственный белок, способный связываться с биотином с высоким сродством. Авидин - другой наиболее заметный биотин-связывающий белок. Первоначально выделенный из яичного желтка, авидин имеет только 30% идентичности последовательности со стрептавидином, но почти идентичен вторичной, третичной и четвертичной структуре. Авидин имеет более высокое сродство к биотину (Kd ~ 10 -15M), но в отличие от стрептавидина, авидин гликозилирован, положительно заряжен, обладает псевдокаталитической активностью (авидин может усиливать щелочной гидролиз сложноэфирной связи между биотином и нитрофенильной группой) и имеет более высокую тенденцию к агрегации. С другой стороны, стрептавидин является лучшим связывающим веществом конъюгата биотина; Авидин имеет более низкую аффинность связывания, чем стрептавидин, когда биотин конъюгирован с другой молекулой, несмотря на то, что авидин имеет более высокое сродство к свободному, неконъюгированному биотину. Поскольку в стрептавидине отсутствуют какие-либо углеводные модификации и его pI близок к нейтральному , его преимущество заключается в гораздо более низком неспецифическом связывании, чем у авидина. Дегликозилированный авидин (NeutrAvidin) более сопоставима с размером, pI и неспецифическим связыванием стрептавидина.

См. Также [ править ]

  • Белковая метка

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Green NM (1975). «Авидин». Достижения в химии белков . 29 : 85–133. DOI : 10.1016 / s0065-3233 (08) 60411-8 . PMID  237414 .
  2. ^ Хендриксон WA, Пэлер A, Смит JL, Satow Y, Мерритт EA, Phizackerley RP (апрель 1989). «Кристаллическая структура основного стрептавидина, определенная по многоволновой аномальной дифракции синхротронного излучения» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 86 (7): 2190–4. DOI : 10.1073 / pnas.86.7.2190 . PMC 286877 . PMID 2928324 .  
  3. ^ Вебер PC, Олендорф DH, Wendoloski JJ, Salemme FR (январь 1989). «Структурное происхождение связывания биотина с высоким сродством к стрептавидину». Наука . 243 (4887): 85–8. DOI : 10.1126 / science.2911722 . PMID 2911722 . 
  4. ^ DeChancie J, Houk KN (май 2007). «Истоки связывания фемтомолярного белка с лигандом: кооперативность водородных связей и энергия десольватации в сайте связывания биотина (стрепта) авидина» . Журнал Американского химического общества . 129 (17): 5419–29. DOI : 10.1021 / ja066950n . PMC 2527462 . PMID 17417839 .  
  5. ^ Chivers CE, Кроза E, Чу C, Moy VT, Sherratt DJ, Хоуарт M (май 2010). «Вариант стрептавидина с более медленной диссоциацией биотина и повышенной механостабильностью» . Методы природы . 7 (5): 391–3. DOI : 10.1038 / nmeth.1450 . PMC 2862113 . PMID 20383133 .  
  6. ^ Jacobsen MT, Fairhead M, Fogelstrand P, Хоуарт M (август 2017). «Аминный ландшафт для максимизации флуоресценции белок-краситель и сверхстабильного взаимодействия белок-лиганд» . Клеточная химическая биология . 24 (8): 1040–1047.e4. DOI : 10.1016 / j.chembiol.2017.06.015 . PMC 5563079 . PMID 28757182 .  
  7. ↑ Holmberg A, Blomstergren A, Nord O, Lukacs M, Lundeberg J, Uhlén M (февраль 2005 г.). «Взаимодействие биотин-стрептавидин может быть обратимо нарушено с использованием воды при повышенных температурах». Электрофорез . 26 (3): 501–10. DOI : 10.1002 / elps.200410070 . PMID 15690449 . 
  8. ^ Ostojic GN, Hersam MC (июнь 2012). «Биомолекулярно-направленная сборка самоподдерживающихся, нанопористых, проводящих и люминесцентных одностенных каркасов из углеродных нанотрубок». Маленький . 8 (12): 1840–5. DOI : 10.1002 / smll.201102536 . PMID 22461319 . 
  9. Перейти ↑ Zhang C, Tian C, Guo F, Liu Z, Jiang W, Mao C (апрель 2012 г.). «ДНК-направленная трехмерная белковая организация». Angewandte Chemie . 51 (14): 3382–5. DOI : 10.1002 / anie.201108710 . PMID 22374892 . 
  10. ^ Fairhead М, Veggiani G, рычаг М, Ян Дж, Mesner D, Робинсон CV, Dushek О, ван - дер - Мерве ПА, Хоуарт М (сентябрь 2014). «Хабы SpyAvidin обеспечивают точную и сверхстабильную ортогональную наносборку» . Журнал Американского химического общества . 136 (35): 12355–63. DOI : 10.1021 / ja505584f . PMC 4183622 . PMID 25111182 .  
  11. ^ Ким M, Ван CC, Бенедетти F, Marszalek PE (февраль 2012). «Наноразмерный зонд силы для измерения межмолекулярных взаимодействий» . Angewandte Chemie . 51 (8): 1903–6. DOI : 10.1002 / anie.201107210 . PMC 3279624 . PMID 22253141 .  
  12. ^ Sinclair JC, Дэвис К., Vénien-Bryan C, Noble ME (июль 2011). «Создание белковых решеток путем слияния белков с соответствующей вращательной симметрией». Природа Нанотехнологии . 6 (9): 558–62. DOI : 10.1038 / nnano.2011.122 . PMID 21804552 . 
  13. ^ Alon R, Bayer EA, Wilchek M (август 1992). «Клеточно-адгезивные свойства стрептавидина опосредуются воздействием RGD-подобного сайта RYD». Европейский журнал клеточной биологии . 58 (2): 271–9. PMID 1425765 . 
  14. ^ Xu XN, Screaton GR (октябрь 2002). «Исследования функции Т-клеток на основе MHC / пептидных тетрамеров». Журнал иммунологических методов . 268 (1): 21–8. DOI : 10.1016 / S0022-1759 (02) 00196-5 . PMID 12213339 . 
  15. ^ Хоуарт M, Chinnapen DJ, Gerrow K, Dorrestein PC, Grandy MR, Келлер NL, Эль-Хусейни A, Ting AY (апрель 2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина» . Методы природы . 3 (4): 267–73. DOI : 10.1038 / nmeth861 . PMC 2576293 . PMID 16554831 .  
  16. ↑ Wu SC, Wong SL (июнь 2005 г.). «Разработка растворимого мономерного стрептавидина с обратимой способностью связывания биотина» . Журнал биологической химии . 280 (24): 23225–31. DOI : 10.1074 / jbc.M501733200 . PMID 15840576 . 
  17. ^ Lim KH, Huang H, Pralle A, S Park (октябрь 2011). «Разработанный мономер и димер стрептавидина с улучшенной стабильностью и функцией». Биохимия . 50 (40): 8682–91. DOI : 10.1021 / bi2010366 . PMID 21892837 . 
  18. ^ Fairhead M, Крндийя D, Lowe ED, Хоуарт M (январь 2014). «Спаривание по принципу« включай и работай »через определенные двухвалентные стрептавидины» . Журнал молекулярной биологии . 426 (1): 199–214. DOI : 10.1016 / j.jmb.2013.09.016 . PMC 4047826 . PMID 24056174 .  
  19. ^ Дубачева, Галина В .; Арая-Каллис, Каролина; Герт Волбеда, Энн; Fairhead, Майкл; Коди, Жерун; Ховарт, Марк; Рихтер, Ральф П. (9 марта 2017 г.). «Контроль поливалентного связывания с помощью химии поверхности: модельное исследование стрептавидина» . Журнал Американского химического общества . 139 (11): 4157–4167. DOI : 10.1021 / jacs.7b00540 . PMC 5364436 . PMID 28234007 .  
  20. ^ Fairhead, Майкл; Веггиани, Джанлука; Рычаг, Мелисса; Ян, июнь; Меснер, Деян; Робинсон, Кэрол В .; Душек, Омер; ван дер Мерве, П. Антон; Ховарт, Марк (21 августа 2014 г.). «Концентраторы SpyAvidin обеспечивают точную и сверхстабильную ортогональную наносборку» . Журнал Американского химического общества . 136 (35): 12355–12363. DOI : 10.1021 / ja505584f . PMC 4183622 . PMID 25111182 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Hutchens TW, Porath JO (сентябрь 1987 г.). «Узнавание белков иммобилизованных лигандов: содействие избирательной адсорбции» . Клиническая химия . 33 (9): 1502–8. PMID  3621554 .
  • Ходош Л.А., Буратовский С. (2001). «Очистка ДНК-связывающих белков с использованием биотиновых / стрептавидиновых аффинных систем». Текущие протоколы в науке о белке . 9.7.1–9.7.13. DOI : 10.1002 / 0471140864.ps0907s12 . ISBN 978-0-471-14086-3.
  • Циммерманн Р.М., Кокс ЕС (февраль 1994 г.). «Растяжение ДНК на функционализированных золотых поверхностях» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (3): 492–7. DOI : 10.1093 / NAR / 22.3.492 . PMC  523609 . PMID  8127690 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Запись Swiss-Prot для предшественника стрептавидина из Streptomyces avidinii
  • Стрептавидин в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
  • Яйцо-стримело полезное взаимодействие Достаточно интересная статья о структуре PDB на PDBe

Группы, исследующие и разрабатывающие стрептавидин или белки семейства авидина (в алфавитном порядке)

  • Лаборатория Ховарта (Оксфордский университет)
  • Лаборатория Hytönen (Университет Тампере)
  • Лаборатория Куломаа (Университет Тампере)
  • Livnah lab (Еврейский университет Иерусалима)
  • Park Lab (Университет Баффало)
  • Лаборатория Стенкампа (Вашингтонский университет)
  • Лаборатория Вонга (Университет Калгари)