Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Количественный принцип аффинного электрофореза проиллюстрирован с помощью электрофореза при pH 8,6 конканавалина А в агарозном геле, содержащем сыворотку крови (3,6 микролитра на квадратный см). Полоска показывает 1 см. Электрофорез проводят в течение ночи при менее 10 В / см. Анализ был проведен в начале 1970-х годов в Белковой лаборатории.

Аффинный электрофорез - это общее название многих аналитических методов, используемых в биохимии и биотехнологии . Как качественная, так и количественная информация может быть получена с помощью аффинного электрофореза. Эти методы включают так называемый анализ сдвига электрофоретической подвижности, электрофорез со сдвигом заряда и аффинный капиллярный электрофорез . Методы основаны на изменении электрофоретической картины молекул (в основном макромолекул ) в результате биоспецифического взаимодействия или комплексообразования . Взаимодействие или связывание заряженной или незаряженной молекулы обычно изменяет электрофоретические свойства молекулы. [1]Мембранные белки можно идентифицировать по сдвигу подвижности, вызванному заряженным детергентом . Нуклеиновые кислоты или фрагменты нуклеиновых кислот могут характеризоваться их сродством к другим молекулам. Эти методы были использованы для оценки константы связывания , как, например , в лектине аффинного электрофорезе или характеристике молекул с конкретными особенностями как гликановое содержанием или лигандом связывания. Для ферментов и других связывающих лиганд белков можно использовать одномерный электрофорез, аналогичный противоэлектрофорезу или «ракетному иммуноэлектрофорезу» , аффинный электрофорез в качестве альтернативного количественного определения белка. [2]Некоторые методы аналогичны аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных лигандов .

Типы и методы [ править ]

В настоящее время продолжаются исследования по разработке новых способов использования знаний, уже связанных с аффинным электрофорезом, для улучшения его функциональности и скорости, а также предпринимаются попытки улучшить уже существующие методы и адаптировать их для выполнения конкретных задач.

Электрофорез в агарозном геле [ править ]

пример геля агарозы после электрофореза

Тип анализа сдвига электрофоретической подвижности (AMSA), электрофорез в агарозном геле, используется для отделения связанных с белком аминокислотных комплексов от свободных аминокислот. Используя низкое напряжение (~ 10 В / см), чтобы минимизировать риск теплового повреждения, через агарозный гель пропускают электричество.

Быстрый электрофорез в агарозном геле [ править ]

В этом методе используется высокое напряжение ( ≥ 20 В / см ) с 0,5 × трис-боратным буфером, проходящим через агарозный гель. [3] Этот метод отличается от традиционного электрофореза в агарозном геле тем, что в нем используется более высокое напряжение, что обеспечивает более короткое время анализа, а также дает более высокое разрешение полос. Другими факторами, включенными в разработку метода быстрого электрофореза в агарозном геле, являются толщина геля и процентное содержание агарозы в геле.

Электрофорез сродства бороната [ править ]

В электрофорезе с боронатным сродством используются акрилимидные гели, насыщенные борной кислотой, для очистки НАД-РНК. Эта очистка позволяет исследователям легко измерить кинетическую активность ферментов, разрушающих НАД-РНК. [4]

Аффинный капиллярный электрофорез [ править ]

Аффинный капиллярный электрофорез (АПФ) относится к ряду методов, которые полагаются на специфические и неспецифические связывающие взаимодействия для облегчения разделения и обнаружения с помощью формульного подхода в соответствии с теорией электромиграции . [5] Используя межмолекулярные взаимодействия между молекулами, происходящими в свободном растворе или мобилизованными на твердую подложку, ACE позволяет разделять и количественно определять концентрации аналитов, а также константы связывания и диссоциации между молекулами. [6] [7] С помощью ACE ученые надеются разработать сильные связывающие лекарства-кандидаты, понять и измерить ферментативную активность, а также охарактеризовать заряды белков. [8]Аффинный капиллярный электрофорез можно разделить на три различных метода: неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов, динамический равновесный АПФ и АПФ на основе аффинности. [6]

Неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов обычно используется для разделения и изучения связывающих взаимодействий больших белков и включает объединение как анализируемого вещества, так и его рецепторной молекулы в предварительно смешанном образце. Эти рецепторные молекулы часто имеют форму аффинных зондов, состоящих из молекул, меченных флуорофором, которые будут связываться с молекулами-мишенями, которые смешиваются с исследуемым образцом. [6] Эта смесь и ее последующие комплексы затем разделяются с помощью капиллярного электрофореза. [6]Поскольку исходная смесь анализируемого вещества и молекулы рецептора были связаны вместе в равновесии, медленная диссоциация этих двух связанных молекул во время электрофоретического эксперимента приведет к их разделению и последующему смещению равновесия в сторону дальнейшей диссоциации. [9] Характерная картина мазка, образованная медленным высвобождением аналита из комплекса во время эксперимента, может быть использована для расчета константы диссоциации комплекса. [9]

Динамическое равновесие ACE включает комбинацию аналита, обнаруженного в образце, и его рецепторной молекулы, обнаруженной в буферном растворе в капиллярной трубке, так что связывание и разделение происходят только в приборе. [6] Для капиллярного электрофореза с динамическим равновесным сродством предполагается, что связывание лиганд-рецептор происходит быстро при смешивании аналита и буфера. Константы связывания обычно получают с помощью этого метода на основе сдвига пика миграции рецептора, который зависит от концентрации анализируемого вещества в образце. [6]

Капиллярный электрофорез на основе аффинности, также известный как капиллярная электроаффинная хроматография (CEC), включает связывание анализируемого вещества в образце с иммобилизованной молекулой рецептора на стенке капилляра, микрошариках или микроканалах. [10] CEC предлагает самую высокую эффективность разделения из всех трех методов ACE, поскольку нематричные компоненты образца вымываются, а затем лиганд высвобождается и анализируется. [6]  

Аффинный капиллярный электрофорез использует преимущества капиллярного электрофореза и применяет их для изучения взаимодействия белков. [8] ACE выгоден тем, что он имеет высокую эффективность разделения, имеет более короткое время анализа, может работать при физиологическом pH и предполагает низкое потребление лиганда / молекул. [11] [12] Кроме того, для проведения исследований АПФ необязательно знать состав интересующего белка. [8] Однако основным недостатком является то, что он не дает много стехиометрической информации об изучаемой реакции. [12]

Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой [ править ]

Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой (PAGE) стал одним из самых популярных методов разделения белков. Это связано не только с его качествами разделения, но и с тем, что его можно использовать в сочетании с множеством других аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг. [7]В этом методе используется двухэтапный подход. Сначала образец белка пропускают через полиакриламидный гель с помощью электрофореза. Затем образец переносится в другой полиакриламидный гель (гель-ловушка для аффинности), где иммобилизованы аффинные зонды. Белки, которые не имеют сродства к зондам сродства, проходят через гель-ловушку сродства, а белки со сродством к зондам будут «захвачены» неподвижными зондами сродства. Эти захваченные белки затем визуализируются и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии после расщепления в геле. [7]

Электрофорез сродства фосфата [ править ]

В электрофорезе сродства к фосфату используется аффинный зонд, который состоит из молекулы, которая специфически связывается с ионами двухвалентного фосфата в нейтральном водном растворе, известного как «Phos-Tag». В этих методах также используется разделительный гель, состоящий из сополимеризованного мономера Phos-Tag с акриламидной связкой. Фосфорилированные белки медленно мигрируют в геле по сравнению с нефосфорилированными белками. Этот метод дает исследователю возможность наблюдать различия в состояниях фосфорилирования любого данного белка. [7]

См. Также [ править ]

  • Иммуноэлектрофорез

Ссылки [ править ]

  1. ^ Aizpurua-Olaizola, Oier; Састре Торано, Хавьер; Пукин, Алексей; Фу, Оу; Бунс, Герт Ян; де Йонг, Герхардус Дж .; Питерс, Роланд Дж. (Январь 2018 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для оценки аффинности связывания ингибиторов холерного токсина на основе углеводов». Электрофорез . 39 (2): 344–347. DOI : 10.1002 / elps.201700207 . PMID  28905402 .
  2. ^ Диб, Сами Эл; Wätzig, Hermann; Эль-Хади, Дея Абд (июль 2013 г.). «Капиллярный электрофорез для исследования биофармацевтических препаратов и фармацевтически значимых связывающих свойств». Тенденции TrAC в аналитической химии . 48 : 112–131. DOI : 10.1016 / j.trac.2013.04.005 .
  3. ^ Ре JA, Льюис Л. К., Льюис К. (октябрь 2016). «Быстрый анализ сдвига электрофоретической подвижности в агарозном геле для количественного определения белка: взаимодействия РНК» . Аналитическая биохимия . 511 : 36–41. DOI : 10.1016 / j.ab.2016.07.027 . PMC 5002362 . PMID 27495142 .  
  4. ^ «Боронатный аффинный электрофорез для очистки и анализа РНК, модифицированной кофактором». Институт фармации и молекулярной биотехнологии Гейдельбергского университета, 69120 Гейдельберг, Германия .
  5. ^ Dubský Р, Дворжак М, Ansorge М (2016). «Аффинный капиллярный электрофорез: теория электромиграции». Аналитическая и биоаналитическая химия . 408 (30): 8623–8641. DOI : 10.1007 / s00216-016-9799-у . PMID 27558099 . 
  6. ^ a b c d e f g Heegaard, Niels H.H; Нильссон, Стаффан; Гусман, Норберто А (11 сентября 1998 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез: важные области применения и некоторые недавние разработки». Журнал хроматографии B: биомедицинские науки и приложения . 715 (1): 29–54. DOI : 10.1016 / S0378-4347 (98) 00258-8 . ISSN 0378-4347 . PMID 9792496 .  
  7. ^ a b c d Киношита, Эйдзи; Киношита-Кикута, Эмико; Коике, Тору (18 марта 2015 г.). «Передовая технология аффинного электрофореза» . Протеомы . 3 (1): 42–55. DOI : 10,3390 / протеомы3010042 . PMC 5302491 . PMID 28248262 .  
  8. ^ a b c Чу, Йен-Хо; Авила, Луис З .; Гао, Цзиньминь; Уайтсайдс, Джордж М. (ноябрь 1995 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез». Счета химических исследований . 28 (11): 461–468. DOI : 10.1021 / ar00059a004 . ISSN 0001-4842 . 
  9. ^ a b Крылов, Сергей Н. (2006). «Неравновесный капиллярный электрофорез равновесных смесей (NECEEM): новый метод биомолекулярного скрининга» . Журнал биомолекулярного скрининга . 11 (2): 115–122. DOI : 10.1177 / 1087057105284339 . ISSN 1087-0571 . PMID 16418314 .  
  10. ^ Dinges, Мередит М .; Солакиилдирим, Кемаль; Ларив, Синтия К. (май 2014 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для определения аффинности связывания низкомолекулярных гепаринов и антитромбина-III: CE и CEC». Электрофорез . 35 (10): 1469–1477. DOI : 10.1002 / elps.201300549 . PMID 24616065 . 
  11. ^ Ю, Фангжи; Чжао, Цян; Чжан, Дапенг; Юань, Чжэн; Ван, Хайлинь (2019-01-02). «Аффинные взаимодействия с помощью капиллярного электрофореза: связывание, разделение и обнаружение». Аналитическая химия . 91 (1): 372–387. DOI : 10.1021 / acs.analchem.8b04741 . ISSN 0003-2700 . PMID 30392351 .  
  12. ^ a b «Аффинный капиллярный электрофорез | Центр обучения MyBioSource» . Проверено 13 декабря 2019 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Исчерпывающие тексты под редакцией Нильса Х. Аксельсена в Скандинавском журнале иммунологии, 1975 г., приложение 4.