Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Аффинная хроматография - это метод отделения биомолекулы от смеси, основанный на высокоспецифическом макромолекулярном связывающем взаимодействии между биомолекулой и другим веществом. Конкретный тип связывающего взаимодействия зависит от интересующей биомолекулы; Взаимодействие связывания антигена и антитела , фермента и субстрата , рецептора и лиганда или белка и нуклеиновой кислоты [1] часто используется для выделения различных биомолекул. Аффинная хроматография полезна благодаря своей высокой селективности и разрешающей способности.разделения, [2] [3] по сравнению с другими хроматографическими методами.

Принцип [ править ]

Аффинная хроматография использует преимущества специфических взаимодействий связывания между представляющим интерес аналитом (обычно растворенным в подвижной фазе ) и партнером связывания или лигандом (иммобилизованным на неподвижной фазе ). В типичном эксперименте по аффинной хроматографии лиганд присоединен к твердой нерастворимой матрице - обычно полимеру, такому как агароза или полиакриламид, - химически модифицированному для введения реактивных функциональных групп, с которыми лиганд может реагировать, образуя стабильные ковалентные связи. [4] Стационарную фазу сначала загружают в колонку, в которую вводят подвижную фазу. Молекулы, которые связываются с лигандом, останутся связанными с неподвижной фазой. Затем применяется промывочный буфер для удаления нецелевых биомолекул путем нарушения их более слабого взаимодействия с неподвижной фазой, в то время как представляющие интерес биомолекулы остаются связанными. Затем биомолекулы-мишени можно удалить с помощью так называемого буфера для элюирования, который нарушает взаимодействия между связанными биомолекулами-мишенями и лигандом. Таким образом, целевая молекула восстанавливается в элюирующем растворе. [5]

Аффинная хроматография не требует знания молекулярной массы, заряда, гидрофобности или других физических свойств интересующего аналита, хотя знание его связывающих свойств полезно при разработке протокола разделения. [5] Типы связывающих взаимодействий, обычно используемые в процедурах аффинной хроматографии, кратко описаны в таблице ниже.

Типичные биологические взаимодействия, используемые в аффинной хроматографии [6]

Старший НетТипы лигандовЦелевая молекула
1Аналог субстратаФерменты
2АнтителаАнтиген
3ЛектинПолисахарид
4Нуклеиновая кислотаДополнительная базовая последовательность
5ГормонРецептор
6АвидинБиотин / биотин-конъюгированная молекула
7КальмодулинПартнер связывания кальмодулина
8ГлутатионСлитый белок GST
9Белки А и GИммуноглобулины
10Ионы металловСлитый белок с поли-гистидином


Настройки партии и столбца [ править ]

Колоночная хроматография
Периодическая хроматография

Связывание с твердой фазой может быть достигнуто с помощью колоночной хроматографии, при которой твердая среда набивается на колонку, исходная смесь проходит через колонку для осаждения, промывочный буфер проходит через колонку, а буфер для элюирования затем наносится на колонку и собирается. . Эти действия обычно выполняются при атмосферном давлении. В качестве альтернативы связывание может быть достигнуто с использованием периодической обработки, например, путем добавления исходной смеси к твердой фазе в сосуде, перемешивания, разделения твердой фазы, удаления жидкой фазы, промывки, повторного центрифугирования, добавления буфера для элюирования, повторное центрифугирование и удаление элюата.

Иногда используется гибридный метод, при котором связывание осуществляется периодическим методом, но твердая фаза со связанной молекулой-мишенью набивается на колонку, а промывание и элюирование осуществляются на колонке.

Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают как из органических, так и из неорганических источников. Примерами биологических источников являются белки сыворотки, лектины и антитела. Неорганические источники в виде дебильных веществ, хелатов металлов и триазиновых красителей. [7]

Также был разработан третий метод, абсорбция расширенным слоем, который сочетает в себе преимущества двух методов, упомянутых выше. Частицы твердой фазы помещаются в колонну, где жидкая фаза закачивается снизу и выходит наверху. Плотность частиц гарантирует, что твердая фаза не покидает колонну с жидкой фазой.

Аффинные колонки можно элюировать путем изменения концентрации солей, pH, pI, заряда и ионной силы напрямую или с помощью градиента для разделения интересующих частиц.

Совсем недавно были разработаны установки, в которых последовательно используется более одной колонки. Преимущество по сравнению с установками с одной колонкой состоит в том, что полимерный материал может быть полностью загружен, поскольку несвязывающий продукт напрямую подается в следующую колонку со свежим материалом колонки. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (PCC). Таким образом, можно резко снизить затраты на смолу на количество произведенного продукта. Поскольку одну колонку всегда можно элюировать и регенерировать, пока загружена другая, уже двух колонок достаточно, чтобы полностью использовать преимущества. [8] Дополнительные колонки могут дать дополнительную гибкость в отношении времени элюирования и регенерации за счет дополнительного оборудования и затрат на смолу.

Конкретное использование [ править ]

Аффинная хроматография может использоваться в ряде приложений, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков [9] из бесклеточных экстрактов и очистку из крови.

Используя аффинную хроматографию, можно отделить белки, которые связываются с определенным фрагментом, от белков, которые не связывают этот конкретный фрагмент. [10] Поскольку этот метод очистки основан на биологических свойствах необходимого белка, это полезный метод, и белки можно очищать многократно за один этап. [11]

Различные медиа по интересам [ править ]

Существует множество различных аффинити-медиа для множества возможных применений. [12] [13] Вкратце, они (обобщенно) активированы / функционализированы, которые работают как функциональный спейсер, поддерживающая матрица и исключают работу с токсичными реагентами.

Аминокислотные среды используются с множеством сывороточных белков, белков, пептидов и ферментов, а также рРНК и дцДНК. Авидин биотиновая среда используется в процессе очистки биотина / авидина и их производных.

Углеводное связывание чаще всего используется с гликопротеинами или любым другим углеводосодержащим веществом; углевод используется с лектинами, гликопротеинами или любым другим белком метаболита углеводов. Среда с красителем-лигандом неспецифична, но имитирует биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, меченных GST. Гепарин - это общий аффинный лиганд, и он наиболее полезен для разделения белков свертывания плазмы, наряду с ферментами нуклеиновых кислот и липазами.

Среды для гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для нацеливания на свободные карбоксильные группы и белки.

Иммуноаффинная среда (подробно описанная ниже) использует высокую специфичность антигенов и антител для разделения; аффинная хроматография с иммобилизованным металлом подробно описана ниже и использует взаимодействия между ионами металлов и белками (обычно специально помеченными) для разделения; нуклеотид / кофермент, который работает для разделения дегидрогеназ, киназ и трансаминаз.

Нуклеиновые кислоты улавливают мРНК, ДНК, рРНК и другие нуклеиновые кислоты / олигонуклеотиды. Метод протеина A / G используется для очистки иммуноглобулинов.

Специальные среды разработаны для определенного класса или типа белка / кофермента; этот тип среды будет работать только для разделения определенного белка или кофермента.

Иммуноаффинность [ править ]

Еще одно применение процедуры - аффинная очистка антител из сыворотки крови. Если известно, что сыворотка содержит антитела против определенного антигена (например, если сыворотка получена из организма, иммунизированного против соответствующего антигена), то ее можно использовать для аффинной очистки этого антигена. Это также известно как иммуноаффинная хроматография. Например, если организм иммунизирован против слитого с GST белка, он будет продуцировать антитела против слитого белка и, возможно, также антитела против GST-метки. Затем белок может быть ковалентно связан с твердой подложкой, такой как агароза, и использован в качестве аффинного лиганда при очистке антитела из иммунной сыворотки.

Для тщательности каждый из белков GST и GST-слитый белок может быть соединен отдельно. Первоначально сыворотке дают возможность связываться с аффинной матрицей GST. Это удалит антитела против GST части гибридного белка. Затем сыворотку отделяют от твердой подложки и дают возможность связываться с матрицей слитого с GST белка. Это позволяет любым антителам, распознающим антиген, улавливаться на твердой подложке. Элюирование представляющих интерес антител чаще всего достигается с использованием буфера с низким pH, такого как глицин pH 2,8. Элюат собирают в нейтральный трисили фосфатный буфер, чтобы нейтрализовать элюирующий буфер с низким pH и остановить любое снижение активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного слитого с GST белка, для удаления нежелательных антител против GST из сыворотки и для очистки целевого антитела.

Моноклональные антитела также могут быть выбраны для связывания белков с высокой специфичностью, когда белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может пригодиться для дальнейших исследований в будущем. [14]

Упрощенная стратегия часто используется для очистки антител, генерируемых против пептидных антигенов . Когда пептидные антигены продуцируются синтетически, концевой остаток цистеина добавляется либо к N-, либо к C-концу пептида. Этот остаток цистеина содержит сульфгидрильную функциональную группу, которая позволяет пептиду легко конъюгировать с белком-носителем (например, гемоцианином лимфы улитки (KLH)). Тот же цистеинсодержащий пептид также иммобилизуется на агарозной смоле через остаток цистеина и затем используется для очистки антитела.

Большинство моноклональных антител были очищены с помощью аффинной хроматографии на основе иммуноглобулин- специфического протеина А или протеина G , полученных из бактерий. [15]

Иммуноаффинная хроматография также является основой для иммунохроматографических тест-полосок (ICT), которые обеспечивают быстрый способ диагностики при лечении пациентов. Используя ИКТ, технический специалист может сделать определение у постели пациента без необходимости в лаборатории. [16] Обнаружение ИКТ очень специфично для микроба, вызывающего инфекцию. [17]

Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов [ править ]

Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) основана на специфической координационной ковалентной связи аминокислот, в частности гистидина, с металлами. Этот метод работает, позволяя белкам со сродством к ионам металлов удерживаться в колонке, содержащей ионы иммобилизованных металлов, таких как кобальт, никель, медь, для очистки гистидин-содержащих белков или пептидов, железа, цинка или галлия для очистки фосфорилированные белки или пептиды. Многие природные белки не обладают сродством к ионам металлов, поэтому технология рекомбинантной ДНК может использоваться для введения такой белковой метки в соответствующий ген. Методы, используемые для элюирования представляющего интерес белка, включают изменение pH или добавление конкурирующей молекулы, такой как имидазол.. [18] [19]

Хроматографическая колонка, содержащая гранулы никель-агарозы, используемая для очистки белков с гистидиновыми метками.
См. Также: Полигистидин-тег

Рекомбинантные белки [ править ]

Возможно, наиболее распространенное использование аффинной хроматографии - очистка рекомбинантных белков. Белки с известной аффинностью помечены белками , чтобы облегчить их очистку. Белок мог быть генетически модифицирован, чтобы позволить его отобрать для аффинного связывания; это известно как гибридный белок. Метки включают гексагистидин ( His ), глутатион- S-трансферазу (GST) и белок, связывающий мальтозу (MBP). Гистидиновые метки имеют сродство к никелю , кобальту , цинку , меди и железу.ионы, которые были иммобилизованы за счет образования координационных ковалентных связей с хелатором, включенным в неподвижную фазу. Для элюирования используется избыточное количество соединения, способного действовать как лиганд иона металла, такого как имидазол . GST имеет сродство к глутатиону, который коммерчески доступен в иммобилизованном виде в виде глутатион-агарозы. Во время элюирования избыток глутатиона используется для вытеснения меченого белка.

Лектины [ править ]

Аффинная хроматография с лектином - это форма аффинной хроматографии, при которой лектины используются для разделения компонентов в образце. Лектины, такие как конканавалин А, представляют собой белки, которые могут связывать определенные молекулы углеводов альфа-D-маннозы и альфа-D-глюкозы. Некоторые общие молекулы углеводов, которые используются в лектиновой аффинной хроматографии, - это Con A-сефароза и WGA-агароза. [20] Другой пример лектина - агглютинин зародышей пшеницы, который связывает DN-ацетил-глюкозамин. [21] Чаще всего применяется для отделения гликопротеинов от негликозилированных белков или для отделения одной гликоформы от другой гликоформы. [22]Хотя существуют различные способы проведения лектиновой аффинной хроматографии, целью является извлечение сахарного лиганда желаемого белка. [20]

Специальность [ править ]

Еще одно применение аффинной хроматографии - очистка определенных белков с использованием гелевой матрицы, уникальной для конкретного белка. Например, очистку β-галактозидазы E. coli проводят с помощью аффинной хроматографии с использованием п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагарозы в качестве аффинной матрицы. п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагароза используется в качестве аффинной матрицы, поскольку она содержит галактопиранозильную группу, которая служит хорошим аналогом субстрата для E.Coli-B-галактозидазы. Это свойство позволяет ферменту связываться с неподвижной фазой аффинной матрицы и элюируется путем добавления увеличивающихся концентраций соли в колонку. [23]

Щелочная фосфатаза [ править ]

Щелочная фосфатаза из E. coli может быть очищена с использованием матрицы DEAE-целлюлоза. A. фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать путем добавления буфера с более высокими концентрациями соли. [24]

Боронатная аффинная хроматография [ править ]

Боронатная аффинная хроматография состоит из использования бороновой кислоты или боронатов для элюирования и количественного определения количества гликопротеинов . Клиническая адаптация применила этот тип хроматографии для использования в долгосрочной оценке пациентов с диабетом посредством анализа их гликозилированного гемоглобина . [21]

Очистка сывороточного альбумина [ править ]

Из многих применений аффинной хроматографии одно из ее применений - аффинная очистка от загрязнения альбумином и макроглобулином. Этот тип очистки полезен для удаления избытка альбумина и загрязнения α 2 -макроглобулином при проведении масс-спектрометрии. При аффинной очистке сывороточного альбумина стационарным устройством, используемым для сбора или привлечения сывороточных белков, может быть Cibacron Blue-Sepharose. Затем сывороточные белки могут быть элюированы с адсорбента буфером, содержащим тиоцианат (SCN - ). [25]

Слабая аффинная хроматография [ править ]

Слабая аффинная хроматография [26] (WAC) - это метод аффинной хроматографии для скрининга аффинности при разработке лекарств. [27] [28] WAC - это метод жидкостной хроматографии на основе аффинности, который разделяет химические соединения на основе их различного слабого сродства к иммобилизованной мишени. Чем выше сродство соединения к мишени, тем дольше оно остается в блоке разделения, и это будет выражаться как более длительное время удерживания. Измерение аффинности и ранжирование сродства может быть достигнуто путем обработки полученных значений времени удерживания анализируемых соединений.

Технология WAC продемонстрирована против ряда различных белковых мишеней - протеаз , киназ , шаперонов и мишеней белок-белкового взаимодействия (PPI). Было показано, что WAC более эффективен, чем известные методы для скрининга на основе фрагментов. [28]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Aizpurua-Olaizola, Oier; Састре Торано, Хавьер; Пукин, Алексей; Fu, Ou; Бунс, Герт Ян; де Йонг, Герхардус Дж .; Питерс, Роланд Дж. (Январь 2018 г.). "Аффинный капиллярный электрофорез для оценки аффинности связывания ингибиторов холерного токсина на основе углеводов". Электрофорез . 39 (2): 344–347. DOI : 10.1002 / elps.201700207 . PMID  28905402 .
  2. ^ Нинфа, Александр J .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Вайли. п. 133. ISBN 9780470087664.
  3. ^ « « Введение в аффинную хроматографию » » . bio-rad.com . Bio-Rad. 2020-09-14 . Проверено 14 сентября 2020 .
  4. ^ Zachariou, Майкл ( под ред.) (2008). Аффинная хроматография: методы и протоколы (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. ISBN 9781588296597.CS1 maint: дополнительный текст: список авторов ( ссылка )
  5. ^ a b Боннер, Филип Л. Р. (2007). Очистка белка (2-е изд.). Тотова, штат Нью-Джерси: Taylor & Francis Group. ISBN 9780415385114.
  6. ^ Кумар, Пранав (2018). Биофизика и молекулярная биология . Нью-Дели: Издание Pathfinder. п. 11. ISBN 978-93-80473-15-4.
  7. ^ Фанали, Сальваторе; Haddad, Paul R .; Пул, Колин Ф .; Шенмейкерс, Питер; Ллойд, Дэвид, ред. (2013). Жидкостная хроматография: приложения . Справочники по разделению науки. Сент-Луис: Эльзевьер. п. 3. ISBN 9780124158061.
  8. ^ Баур, Даниэль; Ангарита, Моника; Мюллер-Шпет, Томас; Штейнебах, Фабиан; Морбиделли, Массимо (2016). «Сравнение периодического и непрерывного процессов захвата белка A на нескольких колонках по оптимальному дизайну». Биотехнологический журнал . 11 (7): 920–931. DOI : 10.1002 / biot.201500481 . PMID 26992151 . 
  9. ^ "Куб Биотех" . Куб Биотех . Проверено 11 сентября 2019 .
  10. ↑ Ахерн, Кевин (12 февраля 2015 г.). Биохимия бесплатно и легко . DaVinci Press; 3-е издание. п. 822.
  11. ^ М., Гришэм, Чарльз (01.01.2013). Биохимия . Брукс / Коул, Cengage Learning. ISBN 978-1133106296. OCLC  777722371 .
  12. ^ "Куб Биотех" . Куб Биотех . Проверено 11 сентября 2019 .
  13. ^ «Аффинная хроматография» .
  14. ^ Томпсон, Нэнси Э .; Фоли, Кэтрин М .; Stalder, Elizabeth S .; Берджесс, Ричард Р. (2009). Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы в энзимологии. 463 . С. 475–494. DOI : 10.1016 / s0076-6879 (09) 63028-7 . ISBN 9780123745361. PMID  19892188 .
  15. ^ Uhlén M (2008). «Близость как инструмент науки о жизни» . Биотехнологии . 44 (5): 649–54. DOI : 10.2144 / 000112803 . PMID 18474040 . 
  16. ^ Луппа, Питер (2018). Тестирование в местах оказания медицинской помощи: принципы и клиническое применение . Берлин, Германия: Springer. С. 71–72. ISBN 9783662544976.
  17. ^ JD Muller; CR Wilks; Кей Джей О'Райли; Р.Дж. Кондрон; Р. Булл; А. Матечун (2004). «Специфика иммунохроматографического теста на сибирскую язву». Австралийский ветеринарный журнал . 82 (4): 220–222. DOI : 10.1111 / j.1751-0813.2004.tb12682.x . PMID 15149073 . 
  18. ^ Singh, Naveen K .; DSouza, Roy N .; Bibi, Noor S .; Фернандес-Лахор, Марсело (2015). «Глава 16 Прямое улавливание белков, меченных His6, с использованием мегапористых криогелей, разработанных для металло-ионной аффинной хроматографии» . В Reichelt, S. (ред.). Аффинная хроматография . Методы молекулярной биологии. 1286 . Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press. С. 201–212. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-2447-9_16 . ISBN 978-1-4939-2447-9. PMID  25749956 .
  19. ^ Габерк-Порекар, Владка К .; Менарт, Виктор (2001). «Перспективы аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом». J Biochem Biophys Methods . 49 (1–3): 335–360. DOI : 10.1016 / S0165-022X (01) 00207-X . PMID 11694288 . 
  20. ^ a b Freeze, HH (май 2001). Лектиновая аффинная хроматография . Текущие протоколы в науке о белке . Глава 9. С. 9.1.1–9.1.9. DOI : 10.1002 / 0471140864.ps0901s00 . ISBN 978-0471140863. ISSN  1934-3663 . PMID  18429210 .
  21. ^ a b Хейдж, Дэвид (май 1999 г.). «Аффинная хроматография: обзор клинического применения» (PDF) . Клиническая химия . 45 (5): 593–615. DOI : 10.1093 / clinchem / 45.5.593 . PMID 10222345 .  
  22. ^ "GE Healthcare Life Sciences, иммобилизованный лектин" . Архивировано из оригинала на 2012-03-03 . Проверено 29 ноября 2010 .
  23. ^ Нинфа, Александр J .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2006). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Вайли. п. 153.
  24. ^ Нинфа, Александр J .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Хобокен, Нью-Джерси: Джон Уайли. п. 240. ISBN 9780470087664. OCLC  420027217 .
  25. ^ Военно-морской флот, Хавьер; Кальво, Мигель; Лампрев, Фермин; Пиньейро, Андрес (1 января 1983 г.). «Аффинная хроматография сывороточного альбумина: иллюстративный лабораторный эксперимент по биомолекулярным взаимодействиям». Биохимическое образование . 11 (1): 5–8. DOI : 10.1016 / 0307-4412 (83) 90004-3 . ISSN 1879-1468 . 
  26. ^ Zopf, D .; С. Олсон (1990). «Слабоаффинная хроматография». Природа . 346 (6279): 87–88. Bibcode : 1990Natur.346 ... 87Z . DOI : 10.1038 / 346087a0 . ISSN 0028-0836 . 
  27. ^ Дуонг-Тхи, Мэриленд; Meiby, E .; Bergström, M .; Fex, T .; Isaksson, R .; Олсон, С. (2011). «Слабая аффинная хроматография как новый подход к скринингу фрагментов при открытии лекарств». Аналитическая биохимия . 414 (1): 138–146. DOI : 10.1016 / j.ab.2011.02.022 . PMID 21352794 . 
  28. ^ a b Meiby, E .; Simmonite, H .; Le Strat, L .; Дэвис, В .; Матасова, Н .; Мур, JD; Мросек, М .; Мюррей, Дж .; Хаббард, RE; Олсон, С. (2013). «Скрининг фрагментов с помощью хроматографии слабого сродства: сравнение с установленными методами скрининга против HSP90». Аналитическая химия . 85 (14): 6756–6766. DOI : 10.1021 / ac400715t . PMID 23806099 . 

Внешние ссылки [ править ]

«Принцип, процедура и предварительное подробное описание аффинной хроматографии - 2020».

Библиотечные ресурсы по
аффинной хроматографии
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках