Капиллярный электрофорез

Капиллярный электрофорез ( КЭ ) - это семейство методов электрокинетического разделения, выполняемых в капиллярах субмиллиметрового диаметра и в микро- и наножидкостных каналах. Очень часто CE относится к электрофорезу капиллярной зоны ( CZE ), но другие методы электрофоретики , включая электрофорез в капиллярном геле (CGE), капиллярное изоэлектрическое фокусирование (CIEF), капиллярный изотахофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография (MEKC) также относятся к этому классу методов. ^[1] В методах КЭ аналиты мигрируют через растворы электролитов под действиемэлектрическое поле . Аналиты можно разделить по ионной подвижности и / или разделить на альтернативную фазу посредством нековалентных взаимодействий . Кроме того, анализируемые вещества могут быть концентрированы или «сосредоточены» с помощью градиентов в проводимости и рН .

Инструменты [ править ]

Рисунок 1: Схема системы капиллярного электрофореза

Аппаратура, необходимая для проведения капиллярного электрофореза, относительно проста. Базовая схема системы капиллярного электрофореза показана на рисунке 1 . Основными компонентами системы являются пробирка с пробой, пробирки источника и назначения, капилляр, электроды , источник питания высокого напряжения , детектор, а также устройство вывода и обработки данных. Пробирка-источник, пробирка-приемник и капилляр заполнены электролитом, например водным буферным раствором. Для ввода пробы капиллярный патрубок помещается во флакон с пробой. Образец вводится в капилляр за счет капиллярного действия., давление, сифонирование или электрокинетика, а затем капилляр возвращается в исходную пробирку. Миграция аналитов инициируется электрическим полем, которое прикладывается между исходной и целевой ампулами и подается на электроды от источника питания высокого напряжения. В наиболее распространенном режиме КЭ все ионы, как положительные, так и отрицательные, протягиваются через капилляр в одном направлении за счет электроосмотического потока . Аналиты разделяются по мере их миграции из-за их электрофоретической подвижности и обнаруживаются около выходного конца капилляра. Выходной сигнал детектора отправляется на устройство вывода и обработки данных, такое как интегратор или компьютер.. Затем данные отображаются в виде электрофореграммы, которая показывает реакцию детектора как функцию времени . Разделенные химические соединения появляются в виде пиков с разным временем миграции на электрофореграмме. ^[2] Эту технику часто приписывают Джеймсу У. Йоргенсену и Кринн ДеАрман Лукач, которые первыми продемонстрировали возможности этой техники. ^[3] Капиллярный электрофорез был впервые объединен с масс-спектрометрией Ричардом Д. Смитом.и коллег, и обеспечивает чрезвычайно высокую чувствительность для анализа очень малых размеров выборки. Несмотря на очень маленький размер образца (обычно в капилляр вводится всего несколько нанолитров жидкости), высокая чувствительность и резкие пики достигаются частично благодаря стратегиям впрыска, которые приводят к концентрации аналитов в узкой зоне возле входа в капилляр. . Это достигается либо давлением, либо электрокинетическим впрыском, просто путем суспендирования образца в буфере с более низкой проводимостью ( например, с более низкой концентрацией соли), чем в рабочем буфере. Процесс, называемый укладкой образцов с усилением полем (форма изотахофореза) приводит к концентрации аналита в узкой зоне на границе между образцом с низкой проводимостью и рабочим буфером с более высокой проводимостью.

Для достижения большей пропускной способности пробы используются инструменты с набором капилляров для одновременного анализа множества проб. Такие приборы для капиллярного матричного электрофореза (CAE) с 16 или 96 капиллярами используются для секвенирования капиллярной ДНК со средней и высокой пропускной способностью, а входные концы капилляров расположены в пространстве для приема образцов непосредственно из 96-луночных планшетов стандарта SBS. Некоторые аспекты оборудования (например, обнаружение) обязательно более сложны, чем для однокапиллярной системы, но фундаментальные принципы конструкции и работы аналогичны тем, которые показаны на рисунке 1.

Обнаружение [ править ]

Разделение капиллярным электрофорезом может быть обнаружено несколькими устройствами обнаружения. В большинстве коммерческих систем в качестве основного метода обнаружения используется поглощение в УФ или УФ-видимом диапазоне . В этих системах часть самого капилляра используется в качестве ячейки обнаружения. Использование обнаружения в пробирке позволяет обнаруживать разделенные аналиты без потери разрешения. Обычно капилляры, используемые в капиллярном электрофорезе, покрыты полимером (часто полиимидом или тефлоном).) для повышения гибкости. Однако часть капилляра, используемая для обнаружения УФ-излучения, должна быть оптически прозрачной. Для капилляров с полиимидным покрытием сегмент покрытия обычно обжигают или соскабливают, чтобы получить открытое окно длиной несколько миллиметров. Эта оголенная часть капилляра может легко сломаться, а капилляры с прозрачным покрытием позволяют повысить стабильность окна ячейки. Длина пути детектирующей ячейки при капиллярном электрофорезе (~ 50 микрометров ) намного меньше, чем у традиционной УФ-ячейки (~ 1 см ). Согласно закону Бера-Ламберта, чувствительность детектора пропорциональна длине пути ячейки. Для повышения чувствительности длину пути можно увеличить, хотя это приводит к потере разрешения. Сама капиллярная трубка может быть расширена в точке обнаружения, создавая «пузырьковую ячейку» с большей длиной пути, или могут быть добавлены дополнительные трубки в точке обнаружения, как показано на рисунке 2 . Однако оба этих метода уменьшают разрешение разделения. ^[4] Это уменьшение почти незаметно, если в стенке капилляра образуется гладкая аневризма путем нагревания и повышения давления, поскольку пробковый поток может быть сохранен. Это изобретение Гэри ГордонаВ патенте США 5061361 длина пути поглощения обычно увеличивается в три раза. При использовании с УФ-детектором поглощения более широкое поперечное сечение анализируемого вещества в ячейке позволяет получить освещающий луч в два раза больше, что снижает дробовой шум в два раза. Вместе эти два фактора увеличивают чувствительность детектора пузырьковых клеток Agilent Technologies CE в шесть раз по сравнению с чувствительностью с использованием прямого капилляра. Этот элемент и его производство описаны на странице 62 июньского номера журнала Hewlett-Packard за 1995 год. ==

Детектирование флуоресценции также можно использовать в капиллярном электрофорезе для образцов, которые флуоресцируют естественным образом или химически модифицированы для содержания флуоресцентных меток . Этот режим обнаружения обеспечивает высокую чувствительность и улучшенную селективность для этих образцов, но не может использоваться для образцов, которые не флюоресцируют. Многочисленные стратегии мечения используются для создания флуоресцентных производных или конъюгатов нефлуоресцентных молекул, включая белки и ДНК. Установка для обнаружения флуоресценции в системе капиллярного электрофореза может быть сложной. Этот метод требует, чтобы луч света был сфокусирован на капилляре, что может быть затруднительно для многих источников света. ^[4] Лазерно- индуцированная флуоресценция использовалась в системах КЭ с пределом обнаружения всего 10^{От −18} до 10 ⁻²¹ мол. Чувствительность метода объясняется высокой интенсивности от падающего света и способность точно сфокусировать свет на капилляре. ^[2] Обнаружение многоцветной флуоресценции может быть достигнуто путем включения нескольких дихроичных зеркал и полосовых фильтров для разделения излучения флуоресценции между несколькими детекторами ( например, фотоэлектронными умножителями ) или с помощью призмы или решетки для проецирования излучения флуоресценции с разрешенным спектром на позицию -чувствительный детектор, такой как ПЗС-матрица . Системы КЭ с 4- и 5-цветными системами обнаружения LIF обычно используются для секвенирования капиллярной ДНК.и приложения для генотипирования (« дактилоскопия ДНК »). ^{[5] [6]}

Чтобы получить идентичность компонентов образца, капиллярный электрофорез может быть напрямую связан с масс-спектрометрами или спектроскопией комбинационного рассеяния с улучшенной поверхностью (SERS). В большинстве систем капиллярный выпуск вводится в источник ионов, который использует ионизацию электрораспылением (ESI). Полученные ионы затем анализируются масс-спектрометром. Эта установка требует летучих буферных растворов, которые будут влиять на диапазон режимов разделения, которые могут быть использованы, и степень разрешения, которое может быть достигнуто. ^[4] Измерение и анализ в основном выполняются специализированными специалистами.

Для CE-SERS элюенты для капиллярного электрофореза могут быть нанесены на SERS-активную подложку. Время удерживания аналита можно перевести в пространственное расстояние, перемещая SERS-активную подложку с постоянной скоростью во время капиллярного электрофореза. Это позволяет применять последующий спектроскопический метод к конкретным элюентам для идентификации с высокой чувствительностью. Могут быть выбраны SERS-активные субстраты, которые не влияют на спектр аналитов. ^[7]

Способы разделения [ править ]

Разделение соединений капиллярным электрофорезом зависит от дифференциальной миграции аналитов в приложенном электрическом поле. Электрофоретической миграции скорость ( ) анализируемого вещества к электроду противоположного заряда:${\ displaystyle u_ {p}}$

${\ displaystyle u_ {p} = \ mu _ {p} E \,}$

Электрофоретическая подвижность может быть определена экспериментально по времени миграции и напряженности поля:

${\ displaystyle \ mu _ {p} = \ left ({\ frac {L} {t_ {r}}} \ right) \ left ({\ frac {L_ {t}} {V}} \ right)}$

где - расстояние от входа до точки обнаружения, - время, необходимое аналиту для достижения точки обнаружения (время миграции), - приложенное напряжение (напряженность поля), - общая длина капилляра. ^[4] Поскольку электрическое поле воздействует только на заряженные ионы, нейтральные аналиты плохо разделяются капиллярным электрофорезом.${\ displaystyle L}$${\ displaystyle t_ {r}}$${\ displaystyle V}$${\ displaystyle L_ {t}}$

Скорость миграции аналита при капиллярном электрофорезе также будет зависеть от скорости электроосмотического потока (EOF) буферного раствора. В типичной системе электроосмотический поток направлен к отрицательно заряженному катоду, так что буфер протекает через капилляр от исходной ампулы к целевой ампуле. Разделенные различной электрофоретической подвижностью, аналиты мигрируют к электроду с противоположным зарядом. ^[2] В результате отрицательно заряженные аналиты притягиваются к положительно заряженному аноду в противоположность EOF, в то время как положительно заряженные аналиты притягиваются к катоду , в соответствии с EOF, как показано на рисунке 3 .

Скорость электроосмотического потока можно записать как:${\ displaystyle u_ {o}}$

${\ displaystyle u_ {o} = \ mu _ {o} E}$

где - электроосмотическая подвижность, определяемая как:${\displaystyle \mu _{o}}$

${\displaystyle \mu _{o}={\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}}$

где - дзета-потенциал стенки капилляра, - относительная диэлектрическая проницаемость буферного раствора. Экспериментально электроосмотическую подвижность можно определить путем измерения времени удерживания нейтрального аналита. ^[4] Скорость ( ) аналита в электрическом поле может быть определена как:${\displaystyle \zeta }$${\displaystyle \epsilon }$${\displaystyle u}$

${\displaystyle u_{p}+u_{o}=(\mu _{p}+\mu _{o})E}$

Поскольку электроосмотический поток буферного раствора обычно больше, чем электрофоретическая подвижность аналитов, все аналиты переносятся вместе с буферным раствором к катоду. Даже небольшие трехзарядные анионы могут быть перенаправлены на катод за счет относительно мощного EOF буферного раствора. Отрицательно заряженные аналиты дольше задерживаются в капилляре из-за их противоречивой электрофоретической подвижности. ^[2] Порядок миграции, наблюдаемый детектором, показан на рисунке 3 : небольшие многозарядные катионы мигрируют быстро, а небольшие многозарядные анионы надежно удерживаются. ^[4]

Электроосмотический поток наблюдается при приложении электрического поля к раствору в капилляре, имеющем фиксированные заряды на внутренней стенке. Заряд накапливается на внутренней поверхности капилляра, когда буферный раствор помещается внутрь капилляра. В капилляре из плавленого кремнезема силанольные (Si-OH) группы, прикрепленные к внутренней стенке капилляра, ионизируются до отрицательно заряженных силаноатных (Si-O ^- ) групп при значениях pH более трех. Ионизацию стенки капилляра можно усилить, предварительно пропустив основной раствор, такой как NaOH или KOH.через капилляр перед введением буферного раствора. Притягиваясь к отрицательно заряженным силаноатным группам, положительно заряженные катионы буферного раствора образуют два внутренних слоя катионов (называемых двойным диффузным слоем или двойным электрическим слоем) на стенке капилляра, как показано на рисунке 4 . Первый слой называется фиксированным, поскольку он плотно прилегает к силаноатным группам. Внешний слой, называемый подвижным слоем, находится дальше от силаноатных групп. Подвижный катионный слой вытягивается в направлении отрицательно заряженного катода при приложении электрического поля. Поскольку эти катионы сольватированыобъем буферного раствора мигрирует вместе с подвижным слоем, вызывая электроосмотический поток буферного раствора. Другие капилляры, включая тефлоновые капилляры, также демонстрируют электроосмотический поток. EOF этих капилляров, вероятно, является результатом адсорбции электрически заряженных ионов буфера на стенках капилляров. ^[2] Скорость EOF зависит от напряженности поля и плотности заряда стенки капилляра. Плотность заряда стенки пропорциональна pH буферного раствора. Электроосмотический поток будет увеличиваться с увеличением pH до тех пор, пока все доступные силанолы, выстилающие стенку капилляра, не будут полностью ионизированы. ^[4]

В определенных ситуациях, когда сильный электроосомотический поток к катоду нежелателен, внутреннюю поверхность капилляра можно покрыть полимерами, поверхностно-активными веществами или небольшими молекулами, чтобы снизить электроосмос до очень низких уровней, восстанавливая нормальное направление миграции (анионы к аноду, катионов к катоду). Контрольно-измерительная аппаратура обычно включает в себя источники питания с обратной полярностью, что позволяет использовать один и тот же прибор в «нормальном» режиме (с EOF и детектированием вблизи катодного конца капилляра) и в «обратном» режиме (с подавленным или реверсивным EOF и детектированием вблизи анодный конец капилляра). Один из наиболее распространенных подходов к подавлению EOF, описанный Стелланом Хьертеном в 1985 году, заключается в создании ковалентно прикрепленного слоя линейного полиакриламида .^[8] Поверхность капилляра из диоксида кремния сначала модифицируют силановым реагентом, несущим полимеризуемую винильную группу ( например, 3-метакрилоксипропилтриметоксисилан), с последующим введением акриламидного мономера и инициатора свободных радикалов . Акриламид полимеризуется in situ с образованием длинных линейных цепей, некоторые из которых ковалентно связаны с силановым реагентом, связанным со стенками. Существует множество других стратегий ковалентной модификации капиллярных поверхностей. Также распространены динамические или адсорбированные покрытия (которые могут включать полимеры или небольшие молекулы). ^[9] Например, при капиллярном секвенировании ДНК просеивающий полимер (обычно полидиметилакриламид) подавляет электроосмотический поток до очень низкого уровня. ^[10] Помимо модуляции электроосмотического потока, покрытия стенок капилляров могут также служить цели уменьшения взаимодействий между «липкими» аналитами (такими как белки) и стенкой капилляров. Такие взаимодействия стенка-аналит, если они серьезны, проявляются в виде пониженной эффективности пика, асимметричных (хвостовых) пиков или даже полной потери аналита на стенке капилляра.

Эффективность и разрешение [ править ]

Количество теоретических тарелок или эффективность разделения при капиллярном электрофорезе определяется по формуле:

${\displaystyle N={\frac {\mu V}{2D_{m}}}}$

где - количество теоретических тарелок , - кажущаяся подвижность в разделяющей среде, - диффузионный${\displaystyle N}$${\displaystyle \mu }$${\displaystyle D_{m}}$коэффициент аналита. Согласно этому уравнению эффективность разделения ограничивается только диффузией и пропорциональна напряженности электрического поля, хотя практические соображения ограничивают напряженность электрического поля несколькими сотнями вольт на сантиметр. Приложение очень высоких потенциалов (> 20-30 кВ) может привести к искрению или пробою капилляра. Кроме того, приложение сильных электрических полей приводит к резистивному нагреву (джоулева нагреву) буфера в капилляре. При достаточно высокой напряженности поля этот нагрев настолько силен, что внутри капилляра могут возникать радиальные градиенты температуры. Поскольку электрофоретическая подвижность ионов обычно зависит от температуры (из-за как ионизации, зависящей от температуры, так и вязкости растворителя),Неоднородный температурный профиль приводит к изменению электрофоретической подвижности в капилляре и потере разрешения. Начало значительного джоулева нагрева можно определить, построив «график закона Ома», на котором ток через капилляр измеряется как функция приложенного потенциала. В малых полях ток пропорционален приложенному потенциалу (Закон Ома ), тогда как при более высоких полях ток отклоняется от прямой линии, поскольку нагрев приводит к уменьшению сопротивления буфера. Наилучшее разрешение обычно достигается при максимальной напряженности поля, для которой джоулев нагрев незначителен ( то есть вблизи границы между линейным и нелинейным режимами графика закона Ома). Обычно капилляры с меньшим внутренним диаметром поддерживают использование более высокой напряженности поля из-за улучшенного рассеивания тепла и меньших температурных градиентов по сравнению с более крупными капиллярами, но с недостатками более низкой чувствительности при обнаружении поглощения из-за более короткой длины пути и большей трудностью введения буфера и образец в капилляр (для небольших капилляров требуется большее давление и / или более длительное время для проталкивания жидкости через капилляр).

Эффективность разделения капиллярным электрофорезом обычно намного выше, чем эффективность других методов разделения, таких как ВЭЖХ . В отличие от ВЭЖХ, в капиллярном электрофорезе отсутствует массоперенос между фазами. ^[4] Кроме того, профиль потока в системах, управляемых EOF, является плоским, а не закругленным профилем ламинарного потока, характерным для потока, управляемого давлением, в хроматографических колонках, как показано на рисунке 5 . В результате EOF не вносит значительного вклада в уширение полосы, как в хроматографии под давлением. Разделения капиллярным электрофорезом могут иметь несколько сотен тысяч теоретических тарелок. ^[11]

Разрешение ( ) разделения капиллярного электрофореза можно записать как:${\displaystyle R_{s}}$

${\displaystyle R_{s}={\frac {1}{4}}\left({\frac {\triangle \mu _{p}{\sqrt {N}}}{\mu _{p}+\mu _{o}}}\right)}$

Согласно этому уравнению максимальное разрешение достигается, когда электрофоретическая и электроосмотическая подвижности близки по величине и противоположны по знаку. Кроме того, видно, что для высокого разрешения требуется меньшая скорость и, соответственно, увеличенное время анализа. ^[4]

Помимо диффузии и джоулева нагрева (обсужденных выше), факторы, которые могут снизить разрешающую способность капиллярного электрофореза по сравнению с теоретическими пределами в приведенном выше уравнении, включают, но не ограничиваются ими, конечную ширину пробки для впрыска и окна обнаружения; взаимодействия между аналитом и стенкой капилляра; инструментальные неидеальности, такие как небольшая разница в высоте резервуаров с жидкостью, приводящая к сифонированию; неоднородности электрического поля из-за, например, неидеально обрезанных концов капилляров; истощение буферной емкости резервуаров; и электродисперсия (когда аналит имеет более высокую проводимость, чем фоновый электролит). ^[12] Выявление и сведение к минимуму многочисленных источников расширения полосы является ключом к успешной разработке методов капиллярного электрофореза с целью максимально приблизиться к идеальному разрешению, ограниченному диффузией.

Приложения [ править ]

Капиллярный электрофорез может использоваться для одновременного определения ионов NH ₄ ⁺ ,, Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ и Ca ²⁺ в слюне . ^[13]

Одним из основных приложений КЭ в судебной медицине является разработка методов амплификации и обнаружения фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.(ПЦР), которая привела к быстрому и значительному прогрессу в судебно-медицинском анализе ДНК. Разделение ДНК проводят с использованием тонких капилляров из кварцевого стекла диаметром 50 мм, заполненных просеивающим буфером. Эти капилляры обладают превосходной способностью рассеивать тепло, что позволяет использовать гораздо более высокую напряженность электрического поля, чем электрофорез в пластинчатом геле. Следовательно, разделение капилляров происходит быстро и эффективно. Кроме того, капилляры можно легко заполнить и заменить для эффективных и автоматизированных инъекций. Обнаружение происходит по флуоресценции через окно, вытравленное в капилляре. Доступны как однокапиллярные, так и капиллярно-матричные инструменты с матричными системами, способными обрабатывать 16 или более образцов одновременно для увеличения пропускной способности. ^[14]

В основном судебные биологи используют КЭ для типирования STR из биологических образцов для создания профиля на основе высокополиморфных генетических маркеров, которые различаются у разных людей. Другие новые области применения КЭ включают обнаружение конкретных фрагментов мРНК, чтобы помочь идентифицировать биологическую жидкость или происхождение ткани судебно-медицинского образца. ^[15]

Еще одно применение CE в судебной медицине - анализ чернил, где анализ чернил для струйной печати становится все более необходимым из-за все более частой подделки документов, напечатанных на струйных принтерах. Химический состав чернил дает очень важную информацию в случае поддельных документов и поддельных банкнот. Мицеллярная электрофоретическая капиллярная хроматография (MECC) была разработана и применяется для анализа чернил, извлеченных из бумаги. Из-за их высокой разрешающей способности по сравнению с чернилами, содержащими несколько химически подобных веществ, также можно различить различия между чернилами одного производителя. Это делает его пригодным для оценки происхождения документов на основе химического состава чернил.Стоит отметить, что из-за возможной совместимости одного и того же картриджа с разными моделями принтеров дифференциация чернил на основе их электрофоретических профилей MECC является более надежным методом определения происхождения картриджа с чернилами (его производителя и картриджа). номер), а не исходную модель принтера.^[16]

Специализированный тип CE, аффинный капиллярный электрофорез (ACE), использует взаимодействия межмолекулярного связывания для понимания взаимодействий белок-лиганд. ^[17] Фармацевтические компании используют АПФ по множеству причин, одна из основных - константы ассоциации / связывания для лекарств и лигандов или лекарств и некоторых систем-носителей, таких как мицеллы . Это широко используемый метод из-за его простоты, быстрых результатов и низкого использования аналитов. ^[18]Использование ACE может предоставить конкретные сведения о связывании, разделении и обнаружении аналитов и доказало свою высокую практичность для исследований в области наук о жизни. Аффинный капиллярный электрофорез на основе аптамеров используется для анализа и модификации специфических аффинных реагентов. Модифицированные аптамеры в идеале обладают высокой аффинностью связывания, специфичностью и устойчивостью к нуклеазам. ^[19] Ren et al. включили модифицированные нуклеотиды в аптамеры, чтобы ввести новые конфронтационные особенности и высокоаффинные взаимодействия из гидрофобных и полярных взаимодействий между IL-1α и аптамером. ^[20]Хуанг и др. использует АПФ для исследования белок-белковых взаимодействий с помощью аптамеров. Связывающий α-тромбин аптамер был помечен 6-карбоксифлуоресцеином для использования в качестве селективного флуоресцентного зонда и изучен для выяснения информации о сайтах связывания для взаимодействий белок-белок и белок-ДНК. ^[21]

Капиллярный электрофорез (КЭ) стал важным и экономичным подходом к секвенированию ДНК, который обеспечивает высокую производительность и точность информации о секвенировании. Вулли и Мэтис использовали CE-чип для секвенирования фрагментов ДНК с точностью 97% и скоростью 150 оснований за 540 секунд. ^[22] Они использовали 4-х цветную маркировку и формат обнаружения для сбора флуоресцентных данных. Флуоресценция используется для просмотра концентраций каждой части последовательности нуклеиновой кислоты, A, T, C и G, и эти пики концентрации, которые отображаются на графике после обнаружения, используются для определения последовательности ДНК. ^[22]

Ссылки [ править ]

Дальнейшее чтение [ править ]

Внешние ссылки [ править ]

• CE анимации [1]