Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема изоэлектрической фокусировки

Изоэлектрическая фокусировка ( IEF ), также известная как электрофокусировка , представляет собой метод разделения различных молекул по разнице в их изоэлектрической точке (pI). [1] [2] Это тип зонного электрофореза, обычно выполняемый на белках в геле, который использует тот факт, что общий заряд интересующей молекулы является функцией pH окружающей среды.

Процедура [ править ]

IEF включает добавление раствора амфолита в гели с иммобилизованным градиентом pH (IPG). IPG представляют собой матрицу акриламидного геля, сополимеризованную с градиентом pH, что приводит к полностью стабильным градиентам, за исключением наиболее щелочных (> 12) значений pH. Иммобилизованный градиент pH достигается путем непрерывного изменения соотношения иммобилинов . Иммобилин - это слабая кислота или основание, определяемое его значением pK.

Белок, который находится в области pH ниже его изоэлектрической точки (pI), будет заряжен положительно и поэтому будет мигрировать к катоду (отрицательно заряженному электроду). Однако по мере того, как он мигрирует через градиент увеличения pH, общий заряд белка будет уменьшаться до тех пор, пока белок не достигнет области pH, соответствующей его pI. В этот момент у него нет чистого заряда, и поэтому миграция прекращается (поскольку нет электрического притяжения ни к одному из электродов). В результате белки фокусируются в четкие неподвижные полосы, причем каждый белок располагается в точке градиента pH, соответствующей его pI. Этот метод обеспечивает чрезвычайно высокое разрешение, когда белки, различающиеся одним зарядом, фракционируются на отдельные полосы.

Фокусируемые молекулы распределяются в среде с градиентом pH (обычно создаваемой алифатическими амфолитами ). Электрический ток пропускают через среду, создавая «положительный» анод и «негативный» катодконец. Отрицательно заряженные молекулы перемещаются через градиент pH в среде к «положительному» концу, в то время как положительно заряженные молекулы движутся к «отрицательному» концу. Когда частица движется к полюсу, противоположному ее заряду, она движется через изменяющийся градиент pH, пока не достигнет точки, в которой достигается изоэлектрическая точка pH этой молекулы. В этот момент молекула больше не имеет суммарного электрического заряда (из-за протонирования или депротонирования связанных функциональных групп) и, как таковая, не будет двигаться дальше в геле. Градиент устанавливается перед добавлением представляющих интерес частиц, сначала подвергая раствор небольших молекул, таких как полиамфолиты, с различными значениями pI, электрофорезу.

Этот метод особенно часто применяется при изучении белков , которые разделяются на основе их относительного содержания кислотных и основных остатков , значение которого представлено pI. Белки вводят в гель с иммобилизованным градиентом pH, состоящий из полиакриламида , крахмала или агарозы, где установлен градиент pH. В этом процессе обычно используются гели с большими порами, чтобы устранить любые эффекты «просеивания» или артефакты в pI, вызванные разными скоростями миграции белков разного размера. Изоэлектрическая фокусировка может разрешить белки, которые различаются по значению pI всего на 0,01. [3]Изоэлектрическое фокусирование - это первый этап двумерного гель-электрофореза , при котором белки сначала разделяются по их значению pI, а затем разделяются по молекулярной массе с помощью SDS-PAGE .

Живые клетки [ править ]

Согласно некоторым мнениям [4] [5] живые эукариотические клетки выполняют изоэлектрическую фокусировку белков внутри себя, чтобы преодолеть ограничение скорости метаболической реакции за счет диффузии ферментов и их реагентов, а также для регулирования скорости определенных биохимических процессов. Концентрируя ферменты определенных метаболических путей в отдельных и небольших областях своей внутренней части, клетка может увеличить скорость определенных биохимических путей на несколько порядков. Путем модификации изоэлектрической точки (pI) молекул фермента, например, фосфорилированием или дефосфорилирование, клетка может переносить молекулы фермента между различными частями своего внутреннего пространства, чтобы включать или выключать определенные биохимические процессы.

Микрожидкостный чип на основе [ править ]

Электрофорез на основе микрочипов является многообещающей альтернативой капиллярному электрофорезу, поскольку он может обеспечить быстрый анализ белков, прямую интеграцию с другими микрожидкостными операциями, обнаружение всего канала, нитроцеллюлозные пленки, меньшие размеры образцов и более низкие производственные затраты.

Мульти-перекресток [ править ]

Повышенный спрос на более быстрые и простые в использовании инструменты для разделения белков ускорил эволюцию IEF в сторону разделения в растворе. В этом контексте была разработана многопереходная система ИЭФ для выполнения быстрого разделения ИЭФ без геля. В многопереходной системе IEF используется серия сосудов, через каждый из которых проходит капилляр. [6]Часть капилляра в каждом сосуде заменена полупроницаемой мембраной. Сосуды содержат буферные растворы с разными значениями pH, так что внутри капилляра эффективно устанавливается градиент pH. Буферный раствор в каждом сосуде имеет электрический контакт с делителем напряжения, подключенным к источнику высокого напряжения, который создает электрическое поле вдоль капилляра. Когда образец (смесь пептидов или белков) вводится в капилляр, присутствие электрического поля и градиента pH разделяет эти молекулы в соответствии с их изоэлектрическими точками. Многопереходная система ИЭФ использовалась для разделения смесей триптических пептидов для двумерной протеомики [7] и белков плазмы крови от болезни Альцгеймера.пациентам для открытия биомаркеров. [6]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Бьеллквист, Бенгт; Эк, Кристина; Джорджио Ригетти, Пирс; Джанацца, Элизабетта; Гёрг, Анжелика; Вестермайер, Райнер; Постель, Вильгельм (1982). «Изоэлектрическая фокусировка в иммобилизованных градиентах pH: принцип, методология и некоторые приложения». Журнал биохимических и биофизических методов . 6 (4): 317–339. DOI : 10.1016 / 0165-022X (82) 90013-6 . ISSN  0165-022X . PMID  7142660 .
  2. ↑ Пьер Джорджио Ригетти (1 апреля 2000 г.). Изоэлектрическая фокусировка: теория, методология и применение . Эльзевир. ISBN 978-0-08-085880-7.
  3. ^ Stryer, Луберт: "Biochemie", стр 50. Spektrum Akademischer Verlag, 1996 (немецком)
  4. ^ Flegr J (1990). "Выполняет ли клетка изоэлектрическую фокусировку?" (PDF) . Биосистемы . 24 (2): 127–133. DOI : 10.1016 / 0303-2647 (90) 90005-L . PMID 2249006 .  
  5. ^ Баскин Э.Ф .; Букшпан С; Зильберштейн Г.В. (2006). «pH-индуцированный внутриклеточный транспорт белка». Физическая биология . 3 (2): 101–106. DOI : 10.1088 / 1478-3975 / 3/2/002 . PMID 16829696 . 
  6. ^ a b Пирморадян М .; Асторга-Уэллс Дж., Зубарев Р.А. (2015). «Многопереходное капиллярное изоэлектрическое фокусирующее устройство в сочетании с онлайновым мембранным буферным обменником позволяет изоэлектрическое точечное фракционирование интактных белков плазмы человека для обнаружения биомаркеров» (PDF) . Аналитическая химия . 87 (23): 11840–11846. DOI : 10.1021 / acs.analchem.5b03344 . ЛВП : 10616/44920 . PMID 26531800 .  CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  7. ^ Пирморадиан, М .; Чжан, Б .; Chingin, K .; Astorga-Wells, J .; Зубарев Р.А. (2014). «Изоэлектрическое фокусирующее устройство с мембраной в качестве микропрепаративного фракционатора для двумерной протеомики дробовика». Аналитическая химия . 86 (12): 5728–5732. DOI : 10.1021 / ac404180e . PMID 24824042 .