Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

В биохимии , биотинилирования представляет собой процесс ковалентного присоединения биотина с белком, нуклеиновой кислоты или другой молекулы. Биотинилирование происходит быстро, специфично и вряд ли нарушит естественную функцию молекулы из-за небольшого размера биотина (молекулярная масса = 244,31 г / моль). Биотин связывается со стрептавидином и авидином с чрезвычайно высоким сродством, быстрым действием и высокой специфичностью, и эти взаимодействия используются во многих областях биотехнологии для выделения представляющих интерес биотинилированных молекул. Связывание биотина со стрептавидином и авидином устойчиво к экстремальным температурам, pH и протеолизу, что делает возможным захват биотинилированных молекул в самых разных средах. Также множественный биотинмолекулы могут быть конъюгированы с интересующим белком, что позволяет связывать несколько белковых молекул стрептавидина , авидина или нейтравидина и увеличивает чувствительность обнаружения интересующего белка. Существует большое количество доступных реагентов для биотинилирования, которые используют широкий спектр возможных методов мечения. Благодаря сильному сродству между биотином и стрептавидином, очистка биотинилированных белков была широко используемым подходом для идентификации белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных событий, таких как убиквитилирование [1] в молекулярной биологии.

Методы маркировки [ править ]

Белки можно биотинилировать химически или ферментативно. В химическом биотинилировании используются различные химические процессы конъюгации для получения неспецифического биотинилирования аминов, карбоксилатов, сульфгидрилов и углеводов (например, NHS-сочетание приводит к биотинилированию любых первичных аминов в белке). Ферментативное биотинилирование приводит к биотинилированию определенного лизина в определенной последовательности бактериальной биотинлигазой. [2] Большинство реагентов химического биотинилирования состоят из реакционноспособной группы, присоединенной через линкер к боковой цепи валериановой кислоты биотина. Поскольку биотин-связывающий карман в авидине / стрептавидине скрыт под поверхностью белка, желательны реагенты для биотинилирования, обладающие более длинным линкером, поскольку они позволяют молекуле биотина, когда она прикреплена к своей мишени, быть более доступной для связывания авидина / стрептавидина. / Белок нейтравидин. Этот линкер может также опосредовать растворимость реагентов биотинилирования; линкеры, которые включают полиэтиленгликоль ( ПЭГ), могут сделать нерастворимые в воде реагенты растворимыми или повысить растворимость реагентов биотинилирования, которые уже в некоторой степени растворимы.

Ферментативное биотинилирование [ править ]

В отличие от методов химического биотинилирования, ферментативное биотинилирование позволяет связывать биотин точно с одним остатком, присутствующим в белке. Эта реакция биотинилирования также может идти до завершения, что означает, что продукт генерируется с высокой однородностью и может быть связан со стрептавидином в определенной ориентации, например, для мультимеров MHC . Ферментативное биотинилирование чаще всего осуществляется биотин-холофермент-синтетазой E. coli , также известной как биотинлигаза (BirA, P06709 ). [3] [4]

Наиболее распространенный способ нацеливания на интересующий белок - это слияние белка на его N-конце, C-конце или во внутренней петле с пептидом из 15 аминокислот (GLNDIFEAQKIEWHE), называемый AviTag или акцепторным пептидом (AP). [5] После маркировки белок инкубируют с BirA, позволяя биотинилированию происходить в присутствии биотина и АТФ. [5] Ферментативное биотинилирование можно проводить in vitro, но BirA также специфически реагирует со своим целевым пептидом внутри клеток млекопитающих и бактерий и на поверхности клетки, в то время как другие клеточные белки не модифицируются. [6] [7] [8] Ферментативное биотинилирование также может происходить in vivo, как правило, за счет совместной экспрессии белка, меченного Avitag, и BirA. [9]

Природным субстратом BirA является белок-носитель карбоксила биотина (BCCP). Прежде чем были обнаружены более мелкие метки, для нацеливания необходимо было слить белок со всей BCCP. [10] Белок, слитый BCCP, может распознаваться молекулами биотина in vivo и прикрепляться к нему. [11] Несколько других небольших тегов использовались до AviTag, но AviTag пока является наиболее эффективным. [4]

Биотинилирование первичного амина [ править ]

Наиболее распространенными мишенями для модификации белковых молекул являются первичные аминогруппы, которые присутствуют в виде эпсилонаминов боковой цепи лизина и N-концевых α-аминов. Реагенты для биотинилирования, реагирующие с амином, можно разделить на две группы в зависимости от растворимости в воде .

Сложные эфиры N-гидроксисукцинимида (NHS) плохо растворимы в водных растворах . Для реакций в водном растворе их необходимо сначала растворить в органическом растворителе , а затем разбавить водной реакционной смесью. Наиболее часто используемые органические растворители для этой цели - это диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФ), которые совместимы с большинством белков при низких концентрациях. Из-за гидрофобности сложных эфиров NHS реагенты для биотинилирования NHS также могут диффундировать через клеточную мембрану , что означает, что они будут биотинилировать как внутренние, так и внешние компоненты клетки .

Сложные эфиры сульфо-NHS ​​более растворимы в воде, и их следует растворять в воде непосредственно перед использованием, поскольку они легко гидролизуются. Растворимость в воде сульфо-NHS-сложных эфиров проистекает из их сульфонатной группы на N-гидроксисукцинимидном кольце и устраняет необходимость растворять реагент в органическом растворителе. Сульфо-NHS-эфиры биотина также могут быть использованы в качестве реагентов для биотинилирования клеточной поверхности, поскольку они не проникают через клеточную мембрану .

Химические реакции эфиров NHS- и сульфо-NHS ​​по существу идентичны, поскольку оба они спонтанно реагируют с аминами с образованием амидной связи. Поскольку мишенью для сложного эфира является депротонированный первичный амин, реакция протекает в основных условиях (pH выше 7). Гидролиз эфира NHS является основной конкурирующей реакцией, и скорость гидролиза увеличивается с увеличением pH . NHS- и сульфо-NHS-эфиры имеют период полураспада несколько часов при pH 7 и всего несколько минут при pH 9.

Существует некоторая гибкость в условиях конъюгирования сложных эфиров NHS с первичными аминами. Температура инкубации может составлять от 4 до 37 ° C, значения pH в диапазоне реакции от 7 до 9, а время инкубации колеблется от нескольких минут до 12 часов. Следует избегать использования буферов, содержащих амины (например, трис или глицин ), поскольку они конкурируют с реакцией.

Сульфгидрил биотинилирование [ править ]

Альтернативой биотинилированию первичного амина является мечение сульфгидрильных групп биотином. Поскольку свободные сульфгидрильные группы менее распространены в большинстве белков по сравнению с первичными аминами, сульфгидрилбиотинилирование полезно, когда первичные амины расположены в регуляторном домене (ах) целевого белка или когда требуется пониженный уровень биотинилирования. Сульфгидрильные группы, такие как малеимиды , галогенацетилы и пиридилдисульфиды, требуют свободных сульфгидрильных групп для конъюгации; сначала необходимо восстановить дисульфидные связи, чтобы освободить сульфгидрильные группы для биотинилирования. Если свободные сульфгидрильные группы отсутствуют, лизины можно модифицировать различными реагентами тиолирования ( реагент Траута, SAT (PEG4), SATA и SATP), что приводит к добавлению свободного сульфгидрила. Сульфгидрилбиотинилирование проводят при немного более низком pH (6,5-7,5), чем мечение эфирами NHS.

Помимо цельных белков, биотинилированные пептиды могут быть синтезированы путем введения остатка цистеина (Cys) во время синтеза на конце аминокислотной цепи для получения сайт-специфичного и ориентированного биотинилирования. Нуклеотиды также можно биотинилировать путем включения тиолированных нуклеотидов .

Карбокси-биотинилирование [ править ]

Карбоксильные группы находятся на С-концах белков и на боковых цепях глутамата и аспартата аминокислот. Реагенты биотинилирования, которые нацелены на карбоксильные группы, не имеют карбоксил-реакционноспособного фрагмента как такового, а вместо этого полагаются на карбодиимидный сшивающий агент, такой как EDC, для связывания первичного амина на реагентах биотинилирования с карбоксильной группой на целевом белке.

Биотинилирование по карбоксильным группам происходит при pH 4,5–5,5. Чтобы предотвратить перекрестную реакцию сшивающего агента с компонентами буфера, буферы не должны содержать первичных аминов (например, трис , глицин ) или карбоксилов (например, ацетат , цитрат ); Буфер MES - идеальный выбор.

Биотинилирование гликопротеинов [ править ]

Гликопротеины можно биотинилировать путем модификации углеводных остатков до альдегидов , которые затем реагируют с реагентами биотинилирования на основе гидразина или алкоксиамина. Периодат натрия окисляет сиаловые кислоты на гликопротеинах до альдегидов с образованием этих стабильных связей при pH 4–6.

Поликлональные антитела сильно гликозилированы, и поскольку гликозилирование не влияет на активность антител, биотинилирование гликозильных групп является идеальной стратегией для создания биотинилированных антител.

Биотинилирование олигонуклеотидов [ править ]

Олигонуклеотиды легко биотинилируются в процессе синтеза олигонуклеотидов фосфорамидитным методом с использованием коммерческого биотинфосфорамидита. [12] После стандартного снятия защиты полученные конъюгаты могут быть очищены с помощью обращенно-фазовой или анионообменной ВЭЖХ.

Неспецифическое биотинилирование [ править ]

Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования идеальны, когда первичные амины, сульфгидрилы, карбоксилы и углеводы недоступны для маркировки. Эти реагенты зависят от арилазидов, которые активируются ультрафиолетовым светом (УФ;> 350 нм), которые затем вступают в реакцию по связям CH и NH. Поскольку эти типы связей возникают независимо от типа аминокислоты, этот тип биотинилирования называют «неспецифическим».

Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования также можно использовать для активации биотинилирования в определенные моменты эксперимента или в определенных условиях реакции, просто подвергая реакцию УФ-свету в определенное время или в определенных условиях.

Цель [ править ]

Очищение [ править ]

Биотиновую метку можно использовать в аффинной хроматографии вместе с колонкой, с которой связан авидин (или стрептавидин, или нейтравидин ), который является естественным лигандом для биотина. Однако для разрыва взаимодействия авидин / стрептавидин-биотин необходимы жесткие условия (например, 6M GuHCl при pH 1,5), что, скорее всего, денатурирует белок, несущий биотиновую метку. Если требуется выделение меченого белка, лучше пометить белок иминобиотином.. Этот аналог биотина дает прочное связывание с авидином / стрептавидином при щелочном pH, но сродство снижается при понижении pH. Следовательно, функциональный белок, меченный иминобиотином, может быть высвобожден из колонки авидин / стрептавидин путем снижения pH (примерно до pH 4). [13] [14]

Обнаружение [ править ]

Эту метку также можно использовать для обнаружения белка с помощью антител против биотина или стратегий обнаружения, меченных авидином / стрептавидином, таких как репортеры ферментов (например, пероксидаза хрена , щелочная фосфатаза ) или флуоресцентные зонды . Это может быть полезно при локализации с помощью флуоресцентной или электронной микроскопии, [15] анализов ELISA, анализов ELISPOT , вестерн-блоттинга и других иммуноаналитических методов. Обнаружение с помощью моновалентного стрептавидина позволяет избежать кластеризации или агрегации биотинилированной мишени. [16]

Другое использование [ править ]

Не-ковалентная связь образуется между биотином и авидином или стрептавидином имеет аффинность связывания, которая выше , чем у большинства антигенов и антител облигаций и приближается к прочности ковалентной связи . Это очень прочное связывание делает маркировку белков биотином полезным инструментом для таких приложений, как аффинная хроматография с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина для отделения биотинилированного белка от смеси других белков и биохимических веществ. Биотинилированный белок, такой как биотинилированный бычий сывороточный альбумин (БСА), используется в твердофазных анализах в качестве покрытия на поверхности лунок в многолуночных аналитических планшетах. Биотинилирование красных кровяных телецбыл использован в качестве средства определения общего объема крови без использования радиоактивных меток, таких как хром 51, что позволяет определять объем у младенцев с низкой массой тела при рождении и беременных женщин, которые иначе не могли бы подвергнуться воздействию требуемых доз радиоактивности. Более того, биотинилирование молекул MHC для создания мультимеров MHC стало полезным инструментом для идентификации и выделения популяций антиген-специфичных Т-клеток . Совсем недавно было разработано биотинилирование белков in vivo для изучения межбелковых взаимодействий и близости в живых клетках [17] [18] [19]

Определение степени биотинилирования [ править ]

Условия реакции для биотинилирования выбираются таким образом, чтобы молекула-мишень (например, антитело) была помечена молекулами биотина, достаточными для очистки или обнаружения молекулы, но не настолько, чтобы биотин мешал функции молекулы.

Анализ HABA [ править ]

Анализ HABA (2- (4-гидроксиазобензол) бензойная кислота) можно использовать для определения степени биотинилирования. Краситель HABA связан с авидином или стрептавидином и дает характерное поглощение. Когда вводятся биотинилированные белки или другие молекулы, биотин вытесняет краситель, что приводит к изменению оптической плотности при 500 нм. Это изменение прямо пропорционально уровню биотина в образце. Недостатком анализа HABA является то, что он использует большое количество образца.

Стрептавидин гель-сдвиг [ править ]

Степень биотинилирования также можно измерить с помощью сдвига геля стрептавидина, поскольку стрептавидин остается связанным с биотином во время электрофореза в агарозном геле или электрофореза в полиакриламидном геле . Долю биотинилированной мишени можно измерить по изменению интенсивности полосы мишени с избытком стрептавидина или без него, что можно быстро и количественно увидеть для биотинилированных белков при окрашивании кумасси бриллиантовым синим . [20]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Лектес, Бенуа; Миготти, Ребекка; Ли, Со Ён; Рамирес, Хуанма; Бераза, Найара; Мэнсфилд, Билл; Сазерленд, Джеймс Д.; Мартинес-Чантар, Мария Л .; Диттмар, Гуннар (06.06.2014). «Профилирование убиквитина в печени с использованием трансгенной мыши с биотинилированным убиквитином». Журнал протеомных исследований . 13 (6): 3016–3026. DOI : 10.1021 / pr5001913 . ISSN  1535-3893 . PMID  24730562 .
  2. ^ Барат, Бхасвати; Ву, Анна М. (2007). «Метаболическое биотинилирование рекомбинантного антитела биотин-лигазой, удерживаемой в эндоплазматическом ретикулуме» . Биомолекулярная инженерия . 24 (3): 283–91. DOI : 10.1016 / j.bioeng.2007.02.003 . PMC 2682619 . PMID 17379573 .  
  3. ^ Samols, D .; Торнтон, CG; Муртиф, ВЛ; Кумар, Г.К .; Хаазе, ФК; Вуд, HG (1988-05-15). «Эволюционная консервация среди ферментов биотина». Журнал биологической химии . 263 (14): 6461–6464. ISSN 0021-9258 . PMID 2896195 .  
  4. ^ a b Fairhead, M; Ховарт, М (2015). Сайт-специфическое биотинилирование очищенных белков с использованием BirA . Методы молекулярной биологии. 1266 . С. 171–84. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-2272-7_12 . ISBN 978-1-4939-2271-0. PMC  4304673 . PMID  25560075 .
  5. ^ a b Беккет, Дороти; Ковалева, Елена; Шац, Питер Дж. (1999). «Минимальный пептидный субстрат в биотинилировании, катализируемом холофермент-синтетазой» . Белковая наука . 8 (4): 921–9. DOI : 10.1110 / ps.8.4.921 . PMC 2144313 . PMID 10211839 .  
  6. ^ De Boer, E .; Rodriguez, P; Bonte, E; Krijgsveld, J; Кацантони, Э; Черт возьми, А; Grosveld, F; Струбулис, Дж (2003). «Эффективное биотинилирование и одностадийная очистка меченых факторов транскрипции в клетках млекопитающих и трансгенных мышей» . Труды Национальной академии наук . 100 (13): 7480–5. Bibcode : 2003PNAS..100.7480D . DOI : 10.1073 / pnas.1332608100 . PMC 164612 . PMID 12802011 .  
  7. ^ Виенс, Антуан; Мехолд, Ундина; Лерманн, Хайке; Харел-Беллан, Анник; Огрызко, Василий (2004). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия . 325 (1): 68–76. DOI : 10.1016 / j.ab.2003.10.015 . PMID 14715286 . 
  8. ^ Ховарт, Марк; Такао, Кейдзо; Хаяси, Ясунори; Тинг, Алиса Ю. (2005). «Нацеливание квантовых точек на поверхностные белки в живых клетках с биотинлигазой» . Труды Национальной академии наук . 102 (21): 7583–8. Bibcode : 2005PNAS..102.7583H . DOI : 10.1073 / pnas.0503125102 . JSTOR 3375578 . PMC 1129026 . PMID 15897449 .   
  9. ^ Cull, MG; Шац, П.Дж. (1 января 2000 г.). Биотинилирование белков in vivo и in vitro с использованием небольших пептидных меток . Методы в энзимологии . 326 . С. 430–440. DOI : 10.1016 / s0076-6879 (00) 26068-0 . ISBN 9780121822279. ISSN  0076-6879 . PMID  11036656 .
  10. ^ Аргаранья, CE; Кунц, ID; Биркен, S; Аксель, Р; Кантор, CR (1986). «Молекулярное клонирование и нуклеотидная последовательность гена стрептавидина» . Nucleic Acids Res . 14 (4): 1871–82. DOI : 10.1093 / NAR / 14.4.1871 . PMC 339579 . PMID 3951999 .  
  11. ^ «Биотинирование белков in vivo» .
  12. ^ Пон, Ричард Т. (1991). «Реагент длинноцепочечного биотинфосфорамидита для автоматического синтеза 5'-биотинилированных олигонуклеотидов». Буквы тетраэдра . 32 (14): 1715–8. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 74311-5 .
  13. ^ Хофманн, Клаус; Вуд, Сара У .; Бринтон, Чарльз С.; Montibeller, Judith A .; Финн, Фрэнсис М. (1980). «Колонки аффинности иминобиотина и их применение для получения стрептавидина» . Труды Национальной академии наук . 77 (8): 4666–8. Bibcode : 1980PNAS ... 77.4666H . DOI : 10.1073 / pnas.77.8.4666 . JSTOR 9166 . PMC 349906 . PMID 6933515 .   
  14. ^ Сугавара, Казухару; Камия, Наото; Хирабаяси, Джордж; Курамиц, Хидеки (2005). «Вольтамперометрический анализ гомогенного связывания биотина без стадии разделения с использованием иминобиотина, меченного электроактивным соединением» . Аналитические науки . 21 (8): 897–900. DOI : 10.2116 / analsci.21.897 . PMID 16122157 . 
  15. ^ Виенс, А .; Харпер, Ф .; Pichard, E .; Comisso, M .; Pierron, G .; Огрызко, В. (2008). «Использование биотинилирования белка in vivo для иммуноэлектронной микроскопической локализации конкретной изоформы белка» . Журнал гистохимии и цитохимии . 56 (10): 911–9. DOI : 10,1369 / jhc.2008.951624 . PMC 2544619 . PMID 18574249 .  
  16. ^ Ховарт, Марк; Chinnapen, Daniel JF; Герроу, Кимберли; Доррестейн, Питер С; Гранди, Мелани Р.; Kelleher, Neil L; Эль-Хусейни, штат Алабама; Тинг, Алиса Y (2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина» . Методы природы . 3 (4): 267–73. DOI : 10.1038 / nmeth861 . PMC 2576293 . PMID 16554831 .  
  17. ^ Фернандес-СуаРез, Марта; Чен, Т. Скотт; Тинг, Алиса Ю. (2008). «Обнаружение белок-белкового взаимодействия in vitro и в клетках путем близкого биотинилирования» . Журнал Американского химического общества . 130 (29): 9251–3. DOI : 10.1021 / ja801445p . PMC 2635094 . PMID 18582056 .  
  18. ^ Kulyyassov, Арман; Шоаиб, Мухаммад; Пичугин Андрей; Каннуш, Патрисия; Раманкулов, Эрлан; Липинский, Марк; Огрызко, Василий (2011). «PUB-MS: основанный на масс-спектрометрии метод мониторинга белок-белковой близости in vivo». Журнал протеомных исследований . 10 (10): 4416–27. arXiv : 1108,5657 . DOI : 10.1021 / pr200189p . PMID 21842862 . S2CID 16887424 .  
  19. ^ Shoaib, M .; Кулясов, А .; Робин, С .; Winczura, K .; Тарлыков, П .; Despas, E .; Kannouche, P .; Раманкулов, Э .; Липинский, М .; Огрызко, В. (2012). «ПУБ-НЧИП - метод« биотинилирования in vivo »для изучения хроматина вблизи интересующего белка» . Геномные исследования . 23 (2): 331–40. DOI : 10.1101 / gr.134874.111 . PMC 3561874 . PMID 23038767 .  
  20. ^ Jain, J .; Veggiani, G .; Ховарт, М. (2013). «Нагрузка холестерина и сверхстабильные белковые взаимодействия определяют уровень опухолевого маркера, необходимый для оптимальной изоляции раковых клеток» . Исследования рака . 73 (7): 2310–21. DOI : 10.1158 / 0008-5472.CAN-12-2956 . PMC 3618857 . PMID 23378340 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Hermanson, GT Bioconjugate Techniques. ISBN Academic Press 0-12-342336-8 
  • Обзор биотинилирования - включает дополнительную информацию и цифры реактивных групп, биотина и линкерных областей.
  • Гао, Вэньцин; Ву, Зенгру; Бол, Кейси Э .; Ян, июнь; Miller, Duane D .; Далтон, Джеймс Т. (2005). «Характеристика in vitro метаболизма селективного модулятора рецепторов андрогенов с использованием препаратов ферментов печени человека, крысы и собаки» . Метаболизм и диспозиция лекарств . 34 (2): 243–53. DOI : 10,1124 / dmd.105.007112 . PMC  2039882 . PMID  16272404 .