Удлинение грунтовки

Эта статья может быть слишком технической для понимания большинством читателей . Пожалуйста, помогите улучшить его, чтобы он был понятен неспециалистам , не удаляя технических деталей. ( Октябрь 2014 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения )

Обзор праймера-удлинителя. Интересующий транскрипт содержит урацил на уровне +1 (неизвестно до анализа). 2) Синтезировать праймер с 5'-концом (используя [γ32P] ATP. 3) Сделать кДНК, удлиняя праймер с помощью обратной транскриптазы до 5'-конца транскрипта. 4) Результатом является кДНК расширенного праймера с радиоактивной меткой, которая денатурируется и разделяется на полиакриламидном геле и обнаруживается авторадиографией. Как правило, лестница секвенирования с использованием того же праймера также находится на геле, что позволяет быстро идентифицировать нуклеотид +1 (показан фиолетовым цветом).

Удлинение праймера является методом , при котором 5' концов из РНКА могут быть сопоставлены - то есть, они могут быть упорядочены и надлежащим образом идентифицированы.

Удлинение праймера можно использовать для определения начального сайта транскрипции (конечный сайт не может быть определен этим методом), по которому известна его последовательность. Для этого метода требуется праймер с радиоактивной меткой (обычно длиной 20-50 нуклеотидов), который комплементарен области около 3'-конца мРНК. Праймеру дают возможность отжигаться с РНК, и обратная транскриптаза используется для синтеза кДНК из РНК, пока она не достигнет 5'-конца РНК. Путем денатурирования гибрида и использования кДНК удлиненного праймера в качестве маркера на электрофоретическом геле можно определить сайт начала транскрипции . Обычно это делается путем сравнения его местоположения на геле с последовательностью ДНК (например, секвенирование по Сэнгеру), предпочтительно с использованием того же праймера на цепи матрицы ДНК. Точный нуклеотид, с которого начинается транскрипция, можно точно определить путем сопоставления меченого удлиненного праймера с нуклеотидом-маркером, которые имеют одинаковое расстояние миграции в геле.

Удлинение праймера предлагает альтернативу анализу нуклеазной защиты (картирование нуклеазы S1) для количественной оценки и картирования транскриптов РНК. Гибридизация зонд для удлинения праймера является синтезирован олигонуклеотидом, тогда как отображение S1 , требуется выделение фрагмента ДНК. Оба метода предоставляют информацию, где начинается мРНК, и обеспечивают оценку концентрации транскрипта по интенсивности полосы транскрипта на полученном авторадиографе. Однако, в отличие от картирования S1, удлинение праймера можно использовать только для определения местоположения 5'-конца транскрипта мРНК, поскольку синтез ДНК, необходимый для анализа, зависит от обратной транскриптазы (полимеризуется только в направлении 5 '→ 3').

Удлинение праймера не зависит от сайтов сплайсинга и, таким образом, является предпочтительным в ситуациях, когда промежуточные сайты сплайсинга препятствуют картированию S1. Наконец, удлинение праймера более точное, чем картирование S1, потому что нуклеаза S1, используемая при картировании S1, может «откусить» концы гибрида РНК-ДНК или не разрушить одноцепочечные области полностью, в результате чего транскрипт будет казаться короче или длиннее.

Ссылки [ править ]

Эта статья включает в себя список литературы , связанной литературы или внешних ссылок , но ее источники остаются неясными, поскольку в ней отсутствуют встроенные цитаты . Пожалуйста, помогите улучшить эту статью, добавив более точные цитаты. ( Октябрь 2014 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения )

https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/primer-extension
Шенк Т.Э., К. Роудс, PWJ Rigby и П. Берг. «Биохимическая процедура для производства небольших делеций в ДНК обезьяньего вируса 40». Proccedings of the National Academy of Sciences 72.4 (1975): 1392-396. Распечатать.

Эта статья по молекулярной или клеточной биологии незавершена . Вы можете помочь Википедии, расширив ее .