Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования ДНК, основанный на избирательном включении дидезоксинуклеотидов, завершающих цепь , ДНК-полимеразой во время репликации ДНК in vitro . [1] [2] После того, как он был впервые разработан Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году, он стал наиболее широко используемым методом секвенирования примерно на 40 лет. Впервые он был коммерциализирован компанией Applied Biosystems в 1986 году. [3] В последнее время более крупномасштабное секвенирование по Сэнгеру было заменено методами секвенирования «следующего поколения» , особенно для крупномасштабного автоматизированного генома.анализы. Однако метод Сэнгера по-прежнему широко используется для небольших проектов и для проверки результатов следующего поколения. Он по-прежнему имеет преимущество перед технологиями секвенирования с коротким считыванием (такими как Illumina) в том, что он может производить считывания последовательности ДНК более 500 нуклеотидов .

Метод Сэнгера (обрыва цепи) для секвенирования ДНК.

Метод [ править ]

Флуоресцентные молекулы ddNTP

Классический метод терминации цепи требует одноцепочечной ДНК-матрицы, ДНК- праймера , ДНК-полимеразы , нормальных дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) и модифицированных дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddNTP), последние из которых останавливают удлинение цепи ДНК. В этих обрывающих цепь нуклеотидах отсутствует 3'- ОН группа, необходимая для образования фосфодиэфирной связи между двумя нуклеотидами, из-за чего ДНК-полимераза прекращает удлинение ДНК при включении модифицированного ddNTP. DdNTP могут быть помечены радиоактивно или флуоресцентно для обнаружения в автоматических секвенаторах.

Образец ДНК делится на четыре отдельные реакции секвенирования, содержащие все четыре стандартных дезоксинуклеотида (dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и ДНК-полимеразу. К каждой реакции добавляется только один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP), тогда как остальные добавленные нуклеотиды являются обычными. Концентрация дезоксинуклеотида должна быть примерно в 100 раз выше, чем у соответствующего дидезоксинуклеотида (например, 0,5 мМ dTTP: 0,005 мМ ddTTP), чтобы обеспечить образование достаточного количества фрагментов при сохранении транскрипции полной последовательности (но концентрация ddNTP также зависит от желаемого длина последовательности). [2]Выражаясь в более разумном порядке, в этом процессе необходимы четыре отдельных реакции для тестирования всех четырех ddNTP. После раундов удлинения матричной ДНК из связанного праймера полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза . В оригинальной публикации 1977 г. [2] образование спаренных оснований петель оцДНК было причиной серьезных трудностей в разрешении полос в некоторых местах. Это часто выполняется с использованием денатурирующего геля полиакриламидно- мочевины, при этом каждая из четырех реакций проходит на одной из четырех отдельных дорожек (дорожки A, T, G, C). Полосы ДНК могут быть затем визуализированы авторадиографией или УФ-светом, а последовательность ДНК может быть непосредственно считана сРентгеновская пленка или изображение геля.

Часть геля для секвенирования с радиоактивной меткой

На изображении справа рентгеновская пленка подвергалась воздействию геля, а темные полосы соответствуют фрагментам ДНК разной длины. Темная полоса на дорожке указывает на фрагмент ДНК, который является результатом обрыва цепи после включения дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP). Затем относительные положения различных полос на четырех дорожках снизу вверх используются для считывания последовательности ДНК.

Фрагменты ДНК метят радиоактивной или флуоресцентной меткой на праймере (1), в новой цепи ДНК - меченым dNTP или меченным ddNTP.

Технические варианты секвенирования с окончанием цепи включают мечение нуклеотидами, содержащими радиоактивный фосфор, для нанесения радиоактивной метки или использование праймера, меченного на 5'-конце флуоресцентным красителем. Секвенирование красителей и праймеров облегчает считывание в оптической системе для более быстрого и экономичного анализа и автоматизации. Более поздняя разработка Leroy Hood и соавторов [4] [5] флуоресцентно меченных ddNTP и праймеров заложила основу для автоматизированного высокопроизводительного секвенирования ДНК.

Последовательная лестница путем радиоактивного секвенирования по сравнению с флуоресцентными пиками

Методы обрыва цепи значительно упростили секвенирование ДНК. Например, коммерчески доступны наборы на основе обрыва цепи, которые содержат реагенты, необходимые для секвенирования, предварительно аликвотированные и готовые к использованию. Ограничения включают неспецифическое связывание праймера с ДНК, влияющее на точное считывание последовательности ДНК, и вторичные структуры ДНК, влияющие на точность последовательности.

Секвенирование красителя-терминатора [ править ]

Капиллярный электрофорез

При секвенировании с использованием красителя-терминатора используется мечение ddNTP-терминатора цепи, что позволяет проводить секвенирование в одной реакции, а не в четырех реакциях, как в методе меченых праймеров. При секвенировании с использованием красителя-терминатора каждый из четырех терминаторов дидезоксинуклеотидной цепи метят флуоресцентными красителями, каждый из которых излучает свет с разными длинами волн .

Благодаря большей целесообразности и скорости секвенирование с использованием терминатора красителя в настоящее время является основой автоматизированного секвенирования. Его ограничения включают эффекты красителя из-за различий во включении меченных красителем терминаторов цепи во фрагмент ДНК, что приводит к неравным высотам и формам пиков на электронной хроматограмме следа последовательности ДНК после капиллярного электрофореза (см. Рисунок слева).

Эта проблема была решена с использованием модифицированных ферментных систем ДНК-полимеразы и красителей, которые минимизируют вариабельность включения, а также способов устранения «пятен красителя». Метод секвенирования с использованием красителя-терминатора, наряду с автоматизированными высокопроизводительными анализаторами последовательности ДНК, использовался в подавляющем большинстве проектов по секвенированию до внедрения секвенирования следующего поколения .

Автоматизация и подготовка проб [ править ]

Вид начала примера чтения терминатора красителя

Автоматические инструменты для секвенирования ДНК ( секвенаторы ДНК ) могут секвенировать до 384 образцов ДНК в одной партии. Пакетные прогоны могут выполняться до 24 раз в день. Секвенсоры ДНК разделяют нити по размеру (или длине) с помощью капиллярного электрофореза , они обнаруживают и записывают флуоресценцию красителя и выводят данные в виде хроматограмм флуоресцентных пиков . Секвенирование реакций ( термоциклирование и маркировка), очистка и ресуспендирование образцов в буферном растворевыполняются отдельно перед загрузкой образцов в секвенатор. Ряд коммерческих и некоммерческих программных пакетов может автоматически обрезать некачественные следы ДНК. Эти программы оценивают качество каждого пика и удаляют базовые пики низкого качества (которые обычно расположены на концах последовательности). По точности такие алгоритмы уступают визуальному осмотру человеком-оператором, но подходят для автоматизированной обработки больших наборов данных последовательности.

Проблемы [ править ]

Общие проблемы секвенирования ДНК с помощью метода Сэнгера включают низкое качество первых 15-40 оснований последовательности из-за связывания праймера [ необходима цитата ] и ухудшение качества следов секвенирования после 700-900 оснований. Программное обеспечение для вызова базы, такое как Phred, обычно обеспечивает оценку качества, чтобы помочь в обрезке низкокачественных областей последовательностей. [6] [7]

В случаях, когда фрагменты ДНК клонируются перед секвенированием, полученная последовательность может содержать части вектора клонирования . В противоположность этому , ПЦР основанное клонирование и секвенирование технологии следующего поколения , основанные на пиросеквенирования часто избегать использования векторов клонирования. Недавно были разработаны методы одноэтапного секвенирования по Сэнгеру (комбинированная амплификация и секвенирование), такие как Ampliseq и SeqSharp, которые позволяют быстро секвенировать целевые гены без клонирования или предварительной амплификации. [8] [9]

Современные методы позволяют непосредственно секвенировать только относительно короткие ( длиной 300-1000 нуклеотидов ) фрагменты ДНК за одну реакцию. Основным препятствием для секвенирования фрагментов ДНК, превышающих этот предел размера, является недостаточная способность разделения для разделения больших фрагментов ДНК, которые отличаются по длине только на один нуклеотид.

Микрожидкостное секвенирование Сэнгера [ править ]

Микрофлюидное секвенирование по Сэнгеру - это приложение « лаборатория-на-чипе» для секвенирования ДНК, в котором этапы секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование, очистка образцов и капиллярный электрофорез) интегрированы в чип в масштабе пластины с использованием нанолитровых объемов образцов. Эта технология генерирует длинные и точные считывания последовательностей, устраняя при этом многие существенные недостатки обычного метода Сэнгера (например, высокое потребление дорогостоящих реагентов, использование дорогостоящего оборудования, трудоемкие манипуляции и т. Д.) За счет интеграции и автоматизации этапов секвенирования по Сэнгеру. .

В настоящее время высокопроизводительное секвенирование генома включает фрагментирование генома на небольшие одноцепочечные фрагменты с последующей амплификацией фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применяя метод Сэнгера, каждый фрагмент ДНК необратимо обрывается с включением флуоресцентно меченного дидезокси-цепи нуклеотида, обрывающего цепь, тем самым образуя «лестницу» ДНК из фрагментов, каждый из которых отличается по длине на одно основание и несет специфичную для основания флуоресцентную метку на терминальная база. Затем амплифицированные базовые лестницы разделяются с помощью электрофореза капиллярной матрицы (CAE) с автоматизированным, in situ«Финишное» обнаружение флуоресцентно меченных фрагментов оцДНК, которое обеспечивает упорядоченную последовательность фрагментов. Эти считывания последовательностей затем собираются компьютером в перекрывающиеся или смежные последовательности (называемые «контиги»), которые напоминают полную геномную последовательность после полной сборки. [10]

Методы Сэнгера позволяют получить длину считывания примерно 800 пар оснований (обычно 500-600 пар оснований для необогащенной ДНК). Большая длина считывания в методах Сэнгера демонстрирует значительные преимущества перед другими методами секвенирования, особенно с точки зрения секвенирования повторяющихся областей генома. Проблема данных коротко читаемых последовательностей особенно актуальна при секвенировании новых геномов (de novo) и при секвенировании сильно перестроенных сегментов генома, обычно тех, которые наблюдаются в геномах рака или в областях хромосом, которые демонстрируют структурные вариации. [11]

Применение технологий микрожидкостного секвенирования [ править ]

Другие полезные приложения секвенирования ДНК включают в себя полиморфизм единичного нуклеотида обнаружения (СНП), однонитевой конформационный полиморфизм (SSCP) гетеродуплексный анализ и короткий тандемный повтор анализ (STR). Разрешение фрагментов ДНК в соответствии с различиями в размере и / или конформации является наиболее важным шагом в изучении этих особенностей генома. [10]

Дизайн устройства [ править ]

Чип секвенирования имеет четырехслойную конструкцию, состоящую из трех стеклянных пластин диаметром 100 мм (на которых микропроизводятся элементы устройства) и полидиметилсилоксановой (PDMS) мембраны. Реакционные камеры и каналы капиллярного электрофореза протравлены между двумя верхними стеклянными пластинами, которые термически связаны. Трехмерные межсоединения каналов и микроклапаны образованы ПДМС и стеклянной пластиной нижнего коллектора.

Устройство состоит из трех функциональных блоков, каждый из которых соответствует этапам секвенирования по Сэнгеру. Блок термоциклирования (TC) представляет собой реакционную камеру объемом 250 нанолитров со встроенным резистивным датчиком температуры, микроклапанами и поверхностным нагревателем. Перемещение реагента между верхним цельностеклянным слоем и нижним слоем стекло-PDMS происходит через сквозные отверстия диаметром 500 мкм. После термоциклирования реакционная смесь проходит очистку в камере улавливания / очистки, а затем вводится в камеру капиллярного электрофореза (CE). Блок CE состоит из 30-сантиметрового капилляра, который свернут в компактную форму обратной связи с помощью витков шириной 65 мкм.

Секвенирование химии [ править ]

Термоциклирование
В реакционной камере TC реагент для секвенирования красителя-терминатора, матричная ДНК и праймеры загружаются в камеру TC и подвергаются термоциклированию в течение 35 циклов (при 95 ° C в течение 12 секунд и при 60 ° C в течение 55 секунд).
Очищение
Заряженную реакционную смесь (содержащую удлинительные фрагменты, матричную ДНК и избыточный реактив для секвенирования) пропускают через камеру улавливания / очистки при 30 ° C с помощью электрического поля 33 В / см, приложенного между выходным портом захвата и входным портом. Гель для захвата, через который проходит образец, состоит из 40 мкМ олигонуклеотида (комплементарного праймерам), ковалентно связанного с полиакриламидной матрицей. Удлинительные фрагменты иммобилизуются гелевой матрицей, а избыток праймера, матрицы, свободных нуклеотидов и солей элюируется через порт захвата для отходов. Улавливающий гель нагревают до 67-75 ° C для высвобождения удлиненных фрагментов.
Капиллярный электрофорез
Фрагменты удлинения вводят в камеру CE, где их подвергают электрофорезу в поле 125–167 В / см.

Платформы [ править ]

Платформа Apollo 100 (Microchip Biotechnologies Inc., Дублин, Калифорния) [12] объединяет первые два этапа секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование и очистка) в полностью автоматизированной системе. Производитель заявляет, что образцы готовы к капиллярному электрофорезу в течение трех часов после загрузки образца и реагентов в систему. Платформа Apollo 100 требует субмикролитровых объемов реагентов.

Сравнение с другими методами секвенирования [ править ]

Значения производительности для технологий секвенирования генома, включая методы Сэнгера и методы нового поколения [11] [13] [14]
ТехнологииКоличество полосОбъем впрыска (нл)Время анализаСредняя длина чтенияПропускная способность (включая анализ; Мб / ч )Заливка геляОтслеживание полосы движения
Плита гель96500–10006–8 часов700 п.н.0,0672дада
Капиллярный решетчатый электрофорез961–51–3 часа700 п.н.0,166НетНет
Микрочип960,1–0,56–30 минут430 п.н.0,660НетНет
454 / Roche FLX (2008 г.)<0,0014 часа200–300 п.н.20–30
Иллюмина / Solexa (2008)2–3 дня30–100 п.н.20
ABI / SOLiD (2008)8 дней35 п.н.5–15
Illumina MiSeq (2019)1–3 дня2x75–2x300 п.н.170–250
Иллюмина NovaSeq (2019)1-2 дня2x50–2x150 п.н.22 000–67 000
Ион Торрент Ион 530 (2019)2,5–4 часа200–600 п.н.110–920
BGI MGISEQ-T7 (2019)1 день2x150 п.н.250 000
Pacific Biosciences SMRT (2019)10–20 часов10–30 кб1,300
Oxford Nanopore MinIon (2019)3 дня13–20 кб [15]700

Конечной целью высокопроизводительного секвенирования является разработка недорогих и чрезвычайно эффективных систем для получения расширенных (более длинных) длин чтения. Большая длина считывания каждого отдельного электрофоретического разделения существенно снижает затраты, связанные с секвенированием ДНК de novo, и количество матриц, необходимых для секвенирования контигов ДНК с заданной избыточностью. Microfluidics может позволить более быструю, дешевую и легкую сборку последовательности. [10]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Сэнгер Ф; Колсон А.Р. (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол . 94 (3): 441–8. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (75) 90213-2 . PMID  1100841 .
  2. ^ a b c Сэнгер Ф; Никлен С; Колсон А.Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (12): 5463–7. Bibcode : 1977PNAS ... 74.5463S . DOI : 10.1073 / pnas.74.12.5463 . PMC 431765 . PMID 271968 .  
  3. Перейти ↑ Adams, Jill U. (2008). «Технологии секвенирования ДНК» . Природное образование . Проверено 24 октября 2019 года .
  4. ^ Смит Л. М., Сандерс Дж. З., Кайзер Р. Дж. И др. (1986). «Обнаружение флуоресценции в автоматическом анализе последовательности ДНК». Природа . 321 (6071): 674–9. Bibcode : 1986Natur.321..674S . DOI : 10.1038 / 321674a0 . PMID 3713851 . S2CID 27800972 .  Мы разработали метод частичной автоматизации анализа последовательности ДНК. Детектирование флуоресценции фрагментов ДНК осуществляется с помощью флуорофора, ковалентно присоединенного к олигонуклеотидному праймеру, используемому в ферментативном анализе последовательности ДНК. Для каждой реакции, специфичной для оснований A, C, G и T, используется флуорофор разного цвета. Реакционные смеси объединяются и подвергаются со-электрофорезу в одной пробирке с полиакриламидным гелем, отдельные флуоресцентные полосы ДНК обнаруживаются на дне. трубки, и информация о последовательности получается непосредственно компьютером.
  5. ^ Смит LM; Fung S; Hunkapiller MW; Hunkapiller TJ; Худ ЛЕ (апрель 1985 г.). «Синтез олигонуклеотидов, содержащих алифатическую аминогруппу на 5'-конце: синтез флуоресцентных праймеров ДНК для использования в анализе последовательности ДНК» . Nucleic Acids Res . 13 (7): 2399–412. DOI : 10.1093 / NAR / 13.7.2399 . PMC 341163 . PMID 4000959 .  
  6. ^ "Phred - качественный базовый вызов" . Проверено 24 февраля 2011 .
  7. ^ Ледергербер, C; Дессимоз, К. (2011). «Базовый вызов для платформ секвенирования следующего поколения» . Брифинги по биоинформатике . 12 (5): 489–97. DOI : 10.1093 / нагрудник / bbq077 . PMC 3178052 . PMID 21245079 .  
  8. ^ Мерфи, К .; Berg, K .; Эшлеман, Дж. (2005). «Секвенирование геномной ДНК путем комбинированной реакции амплификации и цикла секвенирования» . Клиническая химия . 51 (1): 35–39. DOI : 10,1373 / clinchem.2004.039164 . PMID 15514094 . 
  9. ^ Сенгупта, Д. .; Куксон, Б. (2010). «SeqSharp: общий подход к улучшению циклического секвенирования, который обеспечивает надежный одностадийный комбинированный метод амплификации и секвенирования» . Журнал молекулярной диагностики . 12 (3): 272–277. DOI : 10,2353 / jmoldx.2010.090134 . PMC 2860461 . PMID 20203000 .  
  10. ^ a b c Кан, Чеук-Вай; Фредлейк, Кристофер П .; Доэрти, Эрин А.С.; Бэррон, Аннелиз Э. (1 ноября 2004 г.). «Секвенирование ДНК и генотипирование в миниатюрных системах электрофореза». Электрофорез . 25 (21–22): 3564–3588. DOI : 10.1002 / elps.200406161 . PMID 15565709 . S2CID 4851728 .  
  11. ^ a b Морозова Елена Сергеевна; Марра, Марко А (2008). «Применение технологий секвенирования нового поколения в функциональной геномике». Геномика . 92 (5): 255–64. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2008.07.001 . PMID 18703132 . 
  12. ^ Microchip Biologies Inc. Аполлон 100
  13. ^ Синвилл, Рондедрик; Сопер, Стивен А. (2007). «Разделение ДНК высокого разрешения с использованием микрочип-электрофореза». Журнал сепарационной науки . 30 (11): 1714–28. DOI : 10.1002 / jssc.200700150 . PMID 17623451 . 
  14. ^ Кумар, Кишор; Коули, Марк; Дэвис, Райан (2019). «Секвенирование нового поколения и новые технологии» . Семинары по тромбозу и гемостазу . 45 (7): 661–673. DOI : 10,1055 / с-0039-1688446 . ISSN 0094-6176 . PMID 31096307 .  
  15. ^ Тайсон, Джон Р .; О'Нил, Найджел Дж .; Джайн, митен; Olsen, Hugh E .; Хитер, Филипп; Снатч, Терренс П. (2018). «Долговременное секвенирование и сборка на основе MinION расширяют эталонный геном Caenorhabditis elegans» . Геномные исследования . 28 (2): 266–274. DOI : 10.1101 / gr.221184.117 . ISSN 1088-9051 . PMC 5793790 . PMID 29273626 .   

Дальнейшее чтение [ править ]

  • https://web.archive.org/web/20120214053015/http://nano.cancer.gov/news_center/nanotech_news_2006-05-30a.asp [ требуется полная ссылка ]
  • https://web.archive.org/web/20120214053039/http://nano.cancer.gov/news_center/monthly_feature_2005_aug.asp [ требуется полная ссылка ]
  • Дьюи, Ф. Э; Пан, S; Уиллер, М. Т; Quake, S.R; Эшли, Э. А (2012). «Секвенирование ДНК: клиническое применение новых технологий секвенирования ДНК» . Тираж . 125 (7): 931–44. DOI : 10.1161 / CIRCULATIONAHA.110.972828 . PMC  3364518 . PMID  22354974 .
  • Сэнгер, F; Колсон, Арканзас; Barrell, BG; Смит, AJH; Роу, BA (1980). «Клонирование одноцепочечного бактериофага как помощь в быстром секвенировании ДНК». Журнал молекулярной биологии . 143 (2): 161–78. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (80) 90196-5 . PMID  6260957 .

Внешние ссылки [ править ]

  • MBI заявляет, что новый инструмент, который автоматизирует процесс пробоподготовки по Сэнгеру, сокращает затраты на реагенты и рабочую силу