Анализ защиты от нуклеаз — это лабораторный метод, используемый в биохимии и генетике для идентификации отдельных молекул РНК в образце гетерогенной РНК, извлеченном из клеток . Этот метод может идентифицировать одну или несколько молекул РНК с известной последовательностью даже при низкой общей концентрации . Экстрагированную РНК сначала смешивают с антисмысловыми РНК или ДНК -зондами, комплементарными интересующей последовательности или последовательностям, и комплементарные нити гибридизуют с образованием двухцепочечной РНК (или гибрида ДНК-РНК). Затем смесь подвергают воздействию рибонуклеаз , которые специфически расщепляют только отдельные-цепочечной РНК, но не обладают активностью в отношении двухцепочечной РНК. Когда реакция завершается, чувствительные участки РНК расщепляются до очень коротких олигомеров или до отдельных нуклеотидов ; выжившие фрагменты РНК комплементарны добавленной антисмысловой цепи и, таким образом, содержат интересующую последовательность.
Зонды получают путем клонирования части представляющего интерес гена в векторе под контролем любого из следующих промоторов, SP6, T7 или T3. Эти промоторы распознаются ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, изначально характерными для бактериофагов. Полученные зонды являются радиоактивными, поскольку их получают путем транскрипции in vitro с использованием радиоактивных UTP. Некомплементированная ДНК или РНК отщепляется нуклеазами. Когда зонд представляет собой молекулу ДНК, используется нуклеаза S1 ; когда зонд представляет собой РНК, можно использовать любую одноцепочечную специфическую рибонуклеазу. Таким образом, уцелевший комплемент зонд-мРНК просто обнаруживается с помощью авторадиографии.
Анализы защиты от нуклеаз используются для картирования интронов и 5'- и 3'- концов транскрибируемых областей генов . Количественные результаты могут быть получены в отношении количества целевой РНК, присутствующей в исходном клеточном экстракте - если мишенью является матричная РНК , это может указывать на уровень транскрипции гена в клетке.
Они также используются для обнаружения присутствия двухцепочечной РНК, присутствие которой может означать интерференцию РНК.
Нозерн-блоттинг - это лабораторный метод, который дает аналогичную информацию. Он медленнее и менее количественный, но также дает точную информацию о размере РНК-мишени. Продукты анализа защиты от нуклеаз ограничены размером исходных зондов из-за разрушения негибридизированной РНК на этапе расщепления нуклеазой.