анализ следов ДНКазы
Анализ следа ДНКазы [1] представляет собой метод следа ДНК из молекулярной биологии / биохимии , который обнаруживает взаимодействие ДНК и белка, используя тот факт, что белок, связанный с ДНК, часто защищает эту ДНК от ферментативного расщепления. Это позволяет локализовать сайт связывания белка на конкретной молекуле ДНК. В этом методе используется фермент дезоксирибонуклеаза (сокращенно ДНКаза) для разрезания ДНК с радиоактивной меткой на концах с последующим гель-электрофорезом для обнаружения полученного паттерна расщепления.
Например, интересующий фрагмент ДНК можно подвергнуть ПЦР - амплификации с использованием 32 P 5'-меченого праймера, в результате чего образуется множество молекул ДНК с радиоактивной меткой на одном конце одной цепи каждой двухцепочечной молекулы. При расщеплении ДНКазой образуются фрагменты. Фрагменты, которые меньше по сравнению с меченым 32 Р концом, будут появляться дальше на геле, чем более длинные фрагменты. Затем гель используется для экспонирования специальной фотопленки.
Характер расщепления ДНК в отсутствие ДНК-связывающего белка, обычно называемого свободной ДНК, сравнивают с характером расщепления ДНК в присутствии ДНК-связывающего белка. Если белок связывается с ДНК, сайт связывания защищен от ферментативного расщепления. Эта защита приведет к образованию чистой области на геле, которая называется «след».
Варьируя концентрацию ДНК-связывающего белка, аффинность связывания белка можно оценить в соответствии с минимальной концентрацией белка, при которой наблюдается след.
