Термодинамика нуклеиновых кислот

Термодинамика нуклеиновых кислот - это исследование того, как температура влияет на структуру нуклеиновой кислоты двухцепочечной ДНК (дцДНК). Температура плавления ( T _m ) определяется как температура, при которой половина нитей ДНК находится в случайном клубке или одноцепочечном (оцДНК) состоянии. T _m зависит от длины молекулы ДНК и ее конкретной нуклеотидной последовательности. ДНК, когда она находится в состоянии, когда две ее нити диссоциированы (т. Е. Молекула дцДНК существует как две независимые нити), считается денатурированной под воздействием высокой температуры.

Концепции [ править ]

Гибридизация [ править ]

Гибридизация - это процесс установления нековалентного , специфичного для последовательности взаимодействия между двумя или более комплементарными цепями нуклеиновых кислот в единый комплекс, который в случае двух цепей называется дуплексом . Олигонуклеотиды , ДНК или РНК будут связываться со своим комплементом в нормальных условиях, поэтому две совершенно комплементарные цепи будут легко связываться друг с другом. Чтобы уменьшить разнообразие и получить наиболее энергетически предпочтительные комплексы, метод, называемый отжигомиспользуется в лабораторной практике. Однако из-за различной молекулярной геометрии нуклеотидов единственное несоответствие между двумя цепями сделает связывание между ними менее энергетически выгодным. Измерение эффектов несовместимости оснований путем количественной оценки температуры, при которой отжигаются две нити, может предоставить информацию о сходстве в последовательности оснований между двумя отжигаемыми цепями. Комплексы можно диссоциировать путем термической денатурации , также называемой плавлением. При отсутствии внешних негативных факторов процессы гибридизации и плавления могут повторяться последовательно до бесконечности, что создает основу для полимеразной цепной реакции . Чаще всего образуются пары нуклеиновых оснований A = T и G≡C, из которых последнее более стабильно.

Денатурация [ править ]

Денатурация ДНК, также называемая плавлением ДНК, представляет собой процесс, при котором двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота раскручивается и разделяется на одноцепочечные цепи за счет разрушения гидрофобных связей между основаниями. См. Гидрофобный эффект . Оба термина используются для обозначения процесса, который происходит при нагревании смеси, хотя «денатурация» также может относиться к разделению цепей ДНК, вызванному химическими веществами, такими как формамид или мочевина . ^[1]

Процесс денатурации ДНК можно использовать для анализа некоторых аспектов ДНК. Поскольку пары оснований цитозина / гуанина обычно сильнее, чем пары оснований аденина / тимина, количество цитозина и гуанина в геноме (так называемое « содержание GC ») можно оценить путем измерения температуры, при которой тает геномная ДНК. ^[2] Более высокие температуры связаны с высоким содержанием GC.

Денатурацию ДНК также можно использовать для обнаружения различий в последовательностях между двумя разными последовательностями ДНК. ДНК нагревают и денатурируют в одноцепочечное состояние, а смесь охлаждают, чтобы позволить цепям повторно гибридизоваться. Гибридные молекулы образуются между похожими последовательностями, и любые различия между этими последовательностями приведут к нарушению спаривания оснований. В геномном масштабе этот метод использовался исследователями для оценки генетического расстояния между двумя видами - процесс, известный как гибридизация ДНК-ДНК . ^[3] В контексте отдельной изолированной области ДНК, денатурирующие гели градиента и гели температурного градиента могут использоваться для обнаружения наличия небольших несоответствий между двумя последовательностями, процесс, известный какгель-электрофорез в температурном градиенте . ^{[4] [5]}

Методы анализа ДНК, основанные на температуре плавления, имеют недостаток в том, что они являются прокси для изучения основной последовательности; Секвенирование ДНК обычно считается более точным методом.

Процесс плавления ДНК также используется в методах молекулярной биологии, особенно в полимеразной цепной реакции . Хотя температура плавления ДНК не является диагностической в ​​методике, методы оценки T _m важны для определения соответствующих температур для использования в протоколе. Температуры плавления ДНК также можно использовать в качестве заместителя для выравнивания сил гибридизации набора молекул, например олигонуклеотидных зондов микрочипов ДНК .

Отжиг [ править ]

Отжиг в генетике , средство для комплементарных последовательностей одноцепочечной ДНК или РНК в паре с помощью водородных связей с образованием двухцепочечной полинуклеотид . Перед тем, как может произойти отжиг, может потребоваться фосфорилирование одной из нитей ферментом, таким как киназа, чтобы обеспечить правильное водородное связывание. Термин отжиг часто используется для описания связывания зонда ДНК или связывания праймера с цепью ДНК во время полимеразной цепной реакции . Этот термин также часто используется для описания реформации ( ренатурации) обратно-комплементарных нитей, которые были разделены нагреванием (термически денатурированы). Такие белки, как RAD52, могут способствовать отжигу ДНК. Отжиг цепи ДНК - ключевой шаг на пути гомологичной рекомбинации . В частности, во время мейоза , синтез-зависимой нить отжиг является основным путем гомологичной рекомбинации.

Укладка [ править ]

Укладка - это стабилизирующее взаимодействие между плоскими поверхностями соседних оснований. Сложение может происходить с любой гранью основания, то есть 5'-5 ', 3'-3' и наоборот. ^[7]

Укладка в «свободные» молекулы нуклеиновой кислоты в основном обусловлена межмолекулярной силой , в частности электростатическим притяжением между ароматическими кольцами, процессом, также известным как пи-стэкинг . В биологических системах с водой в качестве растворителя гидрофобный эффект способствует образованию спирали. ^[8] Стекинг - главный стабилизирующий фактор двойной спирали ДНК. ^[9]

Вклад стэкинга в свободную энергию молекулы можно экспериментально оценить, наблюдая равновесие изогнутого стэка в разорванной ДНК . Такая стабилизация зависит от последовательности. ^[6] Степень стабилизации зависит от концентрации соли и температуры. ^[9]

Термодинамика модели двух состояний [ править ]

Для расчета значений T _m используются несколько формул . ^{[10] [11]} Некоторые формулы более точны при прогнозировании температуры плавления дуплексов ДНК. ^[12] Для олигонуклеотидов ДНК, то есть коротких последовательностей ДНК, термодинамика гибридизации может быть точно описана как процесс с двумя состояниями. В этом приближении можно пренебречь возможностью промежуточных состояний частичного связывания при образовании двухцепочечного состояния из двух одноцепочечных олигонуклеотидов. Исходя из этого предположения, можно элегантно описать термодинамические параметры для образования двухцепочечной нуклеиновой кислоты AB из одноцепочечных нуклеиновых кислот A и B.

AB ↔ A + B

Константа равновесия для этой реакции равна . Согласно уравнению Вант-Гоффа, соотношение между свободной энергией Δ G и K равно Δ G ° = - RT ln K , где R - постоянная закона идеального газа, а T - температура реакции по Кельвину. Это дает для системы нуклеиновых кислот${\ Displaystyle К = {\ гидроразрыва {[A] [B]} {[AB]}}}$

${\ Displaystyle \ Delta G ^ {\ circ} = - RT \ ln {\ frac {[A] [B]} {[AB]}}}$.

Температура плавления T _m возникает, когда половина двухцепочечной нуклеиновой кислоты диссоциирует. Если дополнительных нуклеиновых кислот нет, то [A], [B] и [AB] будут равны и равны половине исходной концентрации двухцепочечной нуклеиновой кислоты, _{исходной} [AB] . Это дает выражение для температуры плавления дуплекса нуклеиновой кислоты

${\ displaystyle T_ {m} = - {\ frac {\ Delta G ^ {\ circ}} {R \ ln {\ frac {[AB] _ {initial}} {2}}}}}$.

Поскольку Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T _m также определяется выражением

${\ displaystyle T_ {m} = {\ frac {\ Delta H ^ {\ circ}} {\ Delta S ^ {\ circ} -R \ ln {\ frac {[AB] _ {initial}} {2}} }}}$.

Термины Δ H ° и Δ S ° обычно относятся к ассоциации, а не к реакции диссоциации (см., Например, метод ближайшего соседа). Эта формула затем превращается в: ^[13]

${\displaystyle T_{m}={\frac {\Delta H^{\circ }}{\Delta S^{\circ }+R\ln([A]_{total}-[B]_{total}/2)}}}$, где [B] _total <[A] _total .

Как уже упоминалось, это уравнение основано на предположении, что в плавлении участвуют только два состояния: двухцепочечное состояние и состояние случайной катушки. Однако нуклеиновые кислоты могут плавиться через несколько промежуточных состояний. Чтобы учесть такое сложное поведение, необходимо использовать методы статистической механики , что особенно актуально для длинных последовательностей.

Оценка термодинамических свойств по последовательности нуклеиновой кислоты [ править ]

В предыдущем абзаце показано, как температура плавления и термодинамические параметры (Δ G ° или Δ H ° и Δ S °) связаны друг с другом. Наблюдая за температурами плавления, можно экспериментально определить термодинамические параметры. И наоборот, что важно для приложений, когда термодинамические параметры данной последовательности нуклеиновой кислоты известны, температура плавления может быть предсказана. Оказывается, для олигонуклеотидов эти параметры могут быть хорошо аппроксимированы моделью ближайшего соседа.

Метод ближайшего соседа [ править ]

Взаимодействие между основаниями на разных нитях в некоторой степени зависит от соседних оснований. Вместо того, чтобы рассматривать спираль ДНК как последовательность взаимодействий между парами оснований, модель ближайшего соседа рассматривает спираль ДНК как последовательность взаимодействий между «соседними» парами оснований. ^[13] Так, например, показанная ниже ДНК имеет взаимодействия ближайших соседей, указанные стрелками.

    ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

5 'CGTTGA 3'

3 'GCAACT 5'

Свободная энергия образования этой ДНК из отдельных цепей, Δ G °, представлена ​​(при 37 ° C) как

Δ G ° ₃₇ (прогноз) = Δ G ° ₃₇ (инициирование C / G) + Δ G ° ₃₇ (CG / GC) + Δ G ° ₃₇ (GT / CA) + Δ G ° ₃₇ (TT / AA) + Δ G ° ₃₇ (TG / AC) + Δ G ° ₃₇ (GA / CT) + Δ G ° ₃₇ ( _запуск A / T)

За исключением члена инициирования C / G, первый член представляет свободную энергию первой пары оснований, CG, в отсутствие ближайшего соседа. Второй член включает как свободную энергию образования второй пары оснований, GC, так и стэкинг-взаимодействие между этой парой оснований и предыдущей парой оснований. Остальные термины определяются аналогично. В общем, свободная энергия образования дуплекса нуклеиновой кислоты равна

${\displaystyle \Delta G_{37}^{\circ }(\mathrm {total} )=\Delta G_{37}^{\circ }(\mathrm {initiations} )+\sum _{i=1}^{10}n_{i}\Delta G_{37}^{\circ }(i)}$,

где представляет собой свободную энергию, связанную с одной из десяти возможных пар нуклеотидов ближайшего соседа, и представляет ее количество в последовательности.${\displaystyle \Delta G_{37}^{\circ }(i)}$${\displaystyle n_{i}}$

Каждый член Δ G ° имеет энтальпийный Δ H ° и энтропийный Δ S ° параметры, поэтому изменение свободной энергии также определяется выражением

${\displaystyle \Delta G^{\circ }(\mathrm {total} )=\Delta H_{\mathrm {total} }^{\circ }-T\Delta S_{\mathrm {total} }^{\circ }}$.

Значения Δ H ° и Δ S ° были определены для десяти возможных пар взаимодействий. Они приведены в Таблице 1 вместе со значением Δ G °, рассчитанным при 37 ° C. Используя эти значения, вычисленное значение Δ G ₃₇ ° для дуплекса ДНК, показанного выше, составляет -22,4 кДж / моль. Экспериментальное значение -21,8 кДж / моль.

Таблица 1. Параметры ближайшего соседа для дуплексов ДНК / ДНК в 1 М NaCl. ^[13]

Последовательность ближайшего соседа (5'-3 '/ 3'-5')	${\displaystyle \Delta H}$° кДж / моль	${\displaystyle \Delta S}$° Дж / (моль · К)	${\displaystyle \Delta G}$° 37 кДж / моль
AA / TT	-33,1	−92,9	-4,26
AT / TA	−30,1	-85,4	−3,67
TA / AT	−30,1	-89,1	−2,50
CA / GT	−35,6	-95,0	−6,12
GT / CA	−35,1	-93,7	-6,09
CT / GA	-32,6	-87,9	-5,40
GA / CT	−34,3	−92,9	−5,51
CG / GC	-44,4	-113,8	−9,07
GC / CG	-41,0	−102,1	-9,36
GG / CC	-33,5	-83,3	−7,66
Клемма A / T базовая пара	9,6	17,2	4,31
Клемма G / C базовая пара	0,4	-11,7	4,05

Параметры, связанные с десятью группами соседей, показанными в таблице 1, определяют по температурам плавления коротких олигонуклеотидных дуплексов. Любопытно, что только восемь из десяти групп независимы.

Модель ближайшего соседа может быть расширена за пределы пар Уотсона-Крика, чтобы включить параметры для взаимодействий между несовпадениями и соседними парами оснований. ^[14] Это позволяет оценивать термодинамические параметры последовательностей, содержащих изолированные несоответствия, например, например (стрелки указывают на несоответствие)

          ↓↓↓

5 'GGACTGACG 3'

3 'CCTGGCTGC 5'

Эти параметры были подобраны на основе экспериментов по плавлению, и расширение таблицы 1, которая включает несоответствия, можно найти в литературе.

Более реалистичным способом моделирования поведения нуклеиновых кислот может быть использование параметров, которые зависят от соседних групп по обе стороны от нуклеотида, что дает таблицу с записями типа «TCG / AGC». Однако это будет включать около 32 групп для пар Уотсона-Крика и даже больше для последовательностей, содержащих несовпадения; Количество экспериментов по плавлению ДНК, необходимых для получения надежных данных для такого большого количества групп, было бы слишком большим. Однако существуют и другие средства для доступа к термодинамическим параметрам нуклеиновых кислот: технология микроматриц позволяет проводить гибридизационный мониторинг десятков тысяч последовательностей параллельно. Эти данные в сочетании с теорией молекулярной адсорбции позволяют определить многие термодинамические параметры в одном эксперименте ^[15] и выйти за рамки модели ближайшего соседа.^[16] В целом предсказания метода ближайшего соседа достаточно хорошо согласуются с экспериментальными результатами, но некоторые неожиданные выпадающие последовательности, требующие дальнейшего понимания, действительно существуют. ^[16] Наконец, мы должны также упомянуть повышенную точность, обеспечиваемую анализами разархивирования одной молекулы, которые позволяют по-новому взглянуть на термодинамику гибридизации ДНК, а также на достоверность модели ближайшего соседа. ^[17]

См. Также [ править ]

• Температура плавления
• Праймер (молекулярная биология) для расчета T _m
• Базовая пара
• Комплементарная ДНК
• Вестерн-блоттинг

Ссылки [ править ]

Внешние ссылки [ править ]

• Расчет T m в OligoAnalyzer - Integrated DNA Technologies
• Расчеты термодинамики ДНК - T m , профиль плавления, несоответствия, расчеты свободной энергии
• Т м Расчет - на bioPHP.org.
• https://web.archive.org/web/20080516194508/http://www.promega.com/biomath/calc11.htm#disc
• Расчет Invitrogen T m
• Программное обеспечение AnnHyb с открытым исходным кодом для расчета T m с использованием метода ближайшего соседа
• Технические примечания Sigma-aldrich
• Расчет Primer3
• «Открытие гибридной Helix и первая ДНК-РНК гибридизация» от Alexander Rich
• uMelt: прогноз кривой плавления
• Инструмент ТМ
• База данных ближайшего соседа: содержит описание параметров ближайшего соседа взаимодействия РНК-РНК и примеры их использования.