Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Негативное изображение геля DGGE, окрашенного бромистым этидием

Гель-электрофорез в температурном градиенте ( TGGE ) и денатурирующий градиентный гель-электрофорез ( DGGE ) являются формами электрофореза, которые используют либо температурный, либо химический градиент для денатурирования образца, когда он движется по акриламидному гелю. TGGE и DGGE можно применять к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК , и (реже) к белкам. TGGE полагается на температурные изменения в структуре для разделения нуклеиновых кислот . DGGE разделяет гены одинакового размера на основе их различной денатурирующей способности, которая определяется их последовательностью пары оснований. DGGE был оригинальной техникой, а TGGE - ее усовершенствованием.

История [ править ]

DGGE был изобретен Леонардом Лерманом , когда он был профессором SUNY в Олбани. [1] [2] [3]

То же оборудование можно использовать для анализа белка , который впервые был проведен Томасом Крейтоном из лаборатории молекулярной биологии MRC , Кембридж, Англия. [4] Аналогичные узоры производятся белками и нуклеиновыми кислотами, но фундаментальные принципы совершенно разные.

TGGE был впервые описан Тэтчер и Ходсоном [5] и Роджером Уортеллом из Технологического института Джорджии. Большая работа была проделана группой Риснера в Германии. Коммерческое оборудование для DGGE можно приобрести у компаний Bio-Rad, INGENY и CBS Scientific; система для TGGE доступна от Biometra.

Гель-электрофорез в градиенте температуры [ править ]

ДНК имеет отрицательный заряд и поэтому будет перемещаться к положительному электроду в электрическом поле. Гель представляет собой молекулярную сетку с отверстиями примерно такого же размера, как диаметр нити ДНК. При приложении электрического поля ДНК начинает двигаться через гель со скоростью, примерно обратно пропорциональной длине молекулы ДНК (более короткие участки ДНК перемещаются быстрее) - это основа для разделения в зависимости от размера в стандартном электрофорезе. .

В TGGE также существует температурный градиент в геле. При комнатной температуре ДНК будет стабильно существовать в двухцепочечной форме. При повышении температуры нити начинают отделяться ( таять ), и скорость их движения через гель резко снижается. Критически важно, что температура, при которой происходит плавление, зависит от последовательности (пары оснований GC более стабильны, чем AT из-за взаимодействий стэкинга, а не из-за разницы в водородных связях [ необходима цитата ] (есть три водородные связи между парой оснований цитозина и гуанина , но только два между аденином и тимином )), поэтому TGGE обеспечивает«зависимый от последовательности, независимый от размера метод» разделения молекул ДНК. TGGE разделяет молекулы и дает дополнительную информацию о плавлении и стабильности (Biometra, 2000).

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез [ править ]

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) работает путем нанесения небольшого образца ДНК (или РНК) на гель для электрофореза, который содержит денатурирующий агент. Исследователи обнаружили, что определенные денатурирующие гели способны вызывать плавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие маленькие, как 200-700 пар оснований .

Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным денатурирующим условиям, расплавленные нити полностью фрагментируются на отдельные нити. Процесс денатурации денатурирующего геля очень резок: «Вместо того, чтобы частично плавиться непрерывно, подобно застежке-молнии, большинство фрагментов плавятся поэтапно. Отдельные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в пределах очень короткого промежутка времени. узкий диапазон денатурирующих условий »(Helms, 1990). Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательностях фрагментов одинаковой длины часто заставляют их частично плавиться в разных положениях градиента и, следовательно, «останавливаться» в разных положениях геля.Путем сравнения плавления полиморфныхФрагменты ДНК бок о бок на денатурирующих градиентных гелях позволяют обнаруживать фрагменты, которые имеют мутации в первом домене плавления (Helms, 1990). Поместив два образца рядом на геле и позволив им денатурировать вместе, исследователи могут легко увидеть даже самые незначительные различия в двух образцах или фрагментах ДНК.

У этого метода есть ряд недостатков: «Химические градиенты, такие как те, что используются в DGGE, не так воспроизводимы, их трудно установить и часто не полностью разрешают гетеродуплексы » (Westburg, 2001). Эти проблемы решает TGGE, который использует температурный, а не химический градиент для денатурирования образца.

Метод [ править ]

Чтобы отделить нуклеиновые кислоты с помощью TGGE, необходимо выполнить следующие шаги: подготовка и заливка гелей, электрофорез, окрашивание и элюирование ДНК. Поскольку необходимо выбрать буферную систему, важно, чтобы система оставалась стабильной в контексте повышения температуры. Таким образом, для приготовления геля обычно используется мочевина ; однако исследователи должны знать, что количество используемой мочевины повлияет на общую температуру, необходимую для разделения ДНК. [6] Гель загружается, образец помещается на гель в соответствии с типом используемого геля - т. Е. Параллельно или перпендикулярно - регулируется напряжение, и образец можно оставить для работы. [6]В зависимости от того, какой тип TGGE будет использоваться, перпендикулярно или параллельно , необходимо подготовить и загрузить разное количество образца. Большее количество одного образца используется с перпендикуляром, в то время как меньшее количество многих образцов используется с параллельным TGGE. После нанесения геля его необходимо окрасить для визуализации результатов. Хотя для этой цели можно использовать целый ряд пятен, окрашивание серебром оказалось наиболее эффективным средством. [6] ДНК может быть элюирована серебром для дальнейшего анализа с помощью ПЦР- амплификации. [6]

Приложения [ править ]

TGGE и DGGE широко используются в биомедицинских и экологических исследованиях; выбранные приложения описаны ниже.

Мутации в мтДНК [ править ]

Согласно недавнему исследованию по Вонгу, Liang, Kwon, Bai, Alper и Gropman, [ править ] TGGE может быть использован для изучения митохондриальной ДНК индивидуума. По словам этих авторов, TGGE был использован для определения двух новых мутаций в митохондриальном геноме : «21-летняя женщина, которая подозревалась в митохондриальной цитопатии, но не имела точечных мутаций и делеций митохондриальной ДНК (мтДНК), прошла скрининг. для неизвестных мутаций во всем митохондриальном геноме с помощью гель-электрофореза в градиенте температуры ». [7]

мутация p53 в секрете поджелудочной железы [ править ]

Лор и соавторы (2001) сообщают , [ править ] , что в комплексном исследовании поджелудочной железы выделениями лиц без поджелудочной железы , p53мутации можно было обнаружить в соках поджелудочной железы у небольшого процента участников. Поскольку мутации p53 были широко обнаружены в карциномах поджелудочной железы, исследователи этого исследования пытались определить, может ли сама мутация быть связана с развитием рака поджелудочной железы. Хотя Лор смог обнаружить мутации p53 через TGGE у нескольких субъектов, ни у одного из них впоследствии не развилась карцинома поджелудочной железы. Таким образом, исследователи делают вывод, отмечая, что мутация p53 не может быть единственным индикатором онкогенеза карциномы поджелудочной железы.

Микробная экология [ править ]

ДГГЭ небольшой рибосомальной субъединицы генов , кодирующих впервые был описан Gerard Muyzer , [8] в то время как он был пост-док в Leiden University , и стал широко используемым методом в микробной экологии.

ПЦР-амплификация ДНК, экстрагированной из смешанных микробных сообществ, с праймерами для ПЦР, специфичными для фрагментов гена 16S рРНК бактерий и архей , и фрагментов гена 18S рРНК эукариот, приводит к получению смесей продуктов ПЦР. Поскольку все эти ампликоны имеют одинаковую длину, их нельзя отделить друг от друга с помощью электрофореза в агарозном геле. Однако вариации последовательности (т.е. различия в содержании и распределении GC) между разными микробными рРНК приводят к различным свойствам денатурации этих молекул ДНК.

Следовательно, модели полос DGGE можно использовать для визуализации вариаций в генетическом разнообразии микробов и обеспечения приблизительной оценки богатства численности преобладающих членов микробного сообщества. Этот метод часто называют дактилоскопией по месту жительства . Недавно несколько исследований показали, что DGGE функциональных генов (например, генов, участвующих в восстановлении серы, азотфиксации и окислении аммония) может одновременно предоставлять информацию о микробной функции и филогении. Например, Tabatabaei et al. (2009) применили DGGE и впервые смогли выявить микробный образец во время анаэробной ферментации сточных вод завода по производству пальмового масла (POME). [9]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Ячейка. 1979 Янв; 16 (1): 191-200. Независимое от длины разделение рестрикционных фрагментов ДНК в двумерном гель-электрофорезе. Фишер С.Г., Лерман Л.С.
  2. ^ Фишер С.Г. и Лерман Л.С. "Разделение случайных фрагментов ДНК в соответствии со свойствами их последовательностей" Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1980, 77, 4420-4424.
  3. ^ Фишер С.Г. и Лерман Л.С. "Фрагменты ДНК, отличающиеся заменами одной пары оснований, разделяются в денатурирующих градиентных гелях: Соответствие теории плавления" Proc. Natl. Акад. Sci. США, 1983, 80, 1579-1583.
  4. ^ J Mol Biol. 1994 7 октября; 242 (5): 670-82. Электрофоретическая характеристика денатурированных состояний стафилококковой нуклеазы. Крейтон Т.Э., Шортл Д.
  5. ^ Bioochem. J. (1981) 197, 105-109
  6. ^ а б в г (Биометра, 2000). [ необходима цитата ]
  7. ^ (Вонг и др., 2002). [ необходима цитата ]
  8. ^ Muyzer G, де Ваал ЕС, Uitterlinden AG. (1993) Профилирование сложных микробных популяций с помощью анализа денатурирующего градиентного гель-электрофореза амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции генов, кодирующих 16S рРНК. Appl Environ Microbiol. 59: 695-700.
  9. ^ Основанный на ПЦР анализ DGGE и FISH метаногенов в анаэробном закрытом резервуаре варочного котла для очистки сточных вод завода по производству пальмового масла. Мейсам Табатабаи, Мохд Рафейн Закария, Раха Абдул Рахим, Андре-Денис Дж. Райт, Йошихито Шираи, Норхани Абдулла, Кенджи Сакаи, Шинья Икено, Масацугу Мори, Накамура Казунори, Alawi Technology Sulaiman and Mohd Ali Hassan, 2009 Том 12 №3, выпуск от 15 июля 2009 г., ISSN  0717-3458
  • Чарльз Дж. Сэйли, доктор медицины, магистр медицины. Части взяты из итоговой статьи, озаглавленной «TGGE». 2003. Университет наук в Филадельфии.