Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из клонирования ДНК )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Схема молекулярного клонирования с использованием бактерий и плазмид.

Молекулярное клонирование - это набор экспериментальных методов в молекулярной биологии , которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и управления их репликацией в организмах-хозяевах . [1] Использование слова клонирование относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК от двух разных организмов: вида, который является источником ДНК для клонирования, и вида, который будет служить живым хозяином.для репликации рекомбинантной ДНК. Методы молекулярного клонирования занимают центральное место во многих современных областях современной биологии и медицины. [2]

В обычном эксперименте по молекулярному клонированию ДНК, которую нужно клонировать, получают из интересующего организма, а затем обрабатывают ферментами в пробирке для получения более мелких фрагментов ДНК. Впоследствии эти фрагменты объединяются с векторной ДНК для создания рекомбинантных молекул ДНК. Затем рекомбинантная ДНК вводится в организм-хозяин (обычно это простой в выращивании доброкачественный лабораторный штамм бактерий E. coli ). Это создаст популяцию организмов, в которых молекулы рекомбинантной ДНК реплицируются вместе с ДНК хозяина. Поскольку они содержат фрагменты чужеродной ДНК, это трансгенные или генетически модифицированные микроорганизмы ( ГМО ). [3]Этот процесс использует тот факт, что отдельная бактериальная клетка может быть побуждена принять и воспроизвести единственную рекомбинантную молекулу ДНК. Затем эта единственная клетка может быть увеличена экспоненциально, чтобы произвести большое количество бактерий, каждая из которых содержит копии исходной рекомбинантной молекулы. Таким образом, как полученную популяцию бактерий, так и молекулу рекомбинантной ДНК обычно называют «клонами». Строго говоря, рекомбинантная ДНК относится к молекулам ДНК, тогда как молекулярное клонированиеотносится к экспериментальным методам, используемым для их сборки. Возникла идея, что различные последовательности ДНК могут быть вставлены в плазмиду и что эти чужеродные последовательности будут переноситься в бактерии и перевариваться как часть плазмиды. То есть эти плазмиды могут служить векторами клонирования для переноса генов. [4]

Практически любую последовательность ДНК можно клонировать и амплифицировать, но есть некоторые факторы, которые могут ограничить успех процесса. Примерами последовательностей ДНК, которые трудно клонировать, являются инвертированные повторы, точки начала репликации, центромеры и теломеры. Еще одна характеристика, ограничивающая шансы на успех, - это большой размер последовательности ДНК. Вставки размером более 10 кб имеют очень ограниченный успех, но бактериофаги, такие как бактериофаг λ, можно модифицировать для успешной вставки последовательности до 40 кб. [5]

История [ править ]

До 1970-х годов понимание генетики и молекулярной биологии серьезно затруднялось из-за неспособности изолировать и изучать отдельные гены от сложных организмов. Ситуация резко изменилась с появлением методов молекулярного клонирования. Микробиологи, стремящиеся понять молекулярные механизмы, с помощью которых бактерии ограничивают рост бактериофагов, выделили эндонуклеазы рестрикции , ферменты, которые могли расщеплять молекулы ДНК только при обнаружении определенных последовательностей ДНК. [6] Они показали, что рестрикционные ферменты расщепляют молекулы ДНК длиной хромосомы в определенных местах, и что определенные участки более крупной молекулы могут быть очищены фракционированием по размеру. Используя второй фермент, ДНК- лигазу, фрагменты, генерируемые рестрикционными ферментами, могут быть объединены в новые комбинации, называемые рекомбинантной ДНК . Путем рекомбинации представляющих интерес сегментов ДНК с векторной ДНК, такой как бактериофаг или плазмиды, которые естественным образом реплицируются внутри бактерий, можно получить большие количества очищенных рекомбинантных молекул ДНК в бактериальных культурах. Первые рекомбинантные молекулы ДНК были созданы и изучены в 1972 г. [7] [8]

Обзор [ править ]

Молекулярное клонирование использует тот факт, что химическая структура ДНК принципиально одинакова для всех живых организмов. Следовательно, если какой-либо сегмент ДНК из любого организма вставляется в сегмент ДНК, содержащий молекулярные последовательности, необходимые для репликации ДНК , и полученная рекомбинантная ДНК вводится в организм, из которого были получены репликационные последовательности, то чужеродная ДНК будет реплицирована. вместе с ДНК клетки-хозяина в трансгенном организме.

Молекулярное клонирование похоже на полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в том, что оно позволяет репликацию последовательности ДНК. Принципиальное различие между этими двумя методами заключается в том, что молекулярное клонирование включает репликацию ДНК в живом микроорганизме, в то время как ПЦР реплицирует ДНК в растворе in vitro , свободном от живых клеток.

Шаги [ править ]

Общая цель молекулярного клонирования - взять интересующий ген из одной плазмиды и вставить его в другую плазмиду [9]. Это достигается путем проведения ПЦР, реакции пищеварения, реакции лигирования и трансформации.

В стандартных экспериментах по молекулярному клонированию клонирование любого фрагмента ДНК по существу включает семь этапов: (1) выбор организма-хозяина и вектора клонирования, (2) получение векторной ДНК, (3) подготовка ДНК для клонирования, (4) создание рекомбинантной ДНК, (5) Введение рекомбинантной ДНК в организм-хозяин, (6) Отбор организмов, содержащих рекомбинантную ДНК, (7) Скрининг на клоны с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами.

Хотя подробное планирование клонирования может быть выполнено в любом текстовом редакторе, вместе с онлайн-утилитами для, например, дизайна праймеров ПЦР, для этой цели существует специальное программное обеспечение. Программное обеспечение для этой цели включает, например, ApE [1] (открытый исходный код), DNAStrider [2] (открытый исходный код), Serial Cloner [3] (бесплатно) и Collagene [4] (открытый исходный код).

Примечательно, что растущие возможности и точность платформ для синтеза ДНК позволяют создавать все более сложные конструкции в молекулярной инженерии. Эти проекты могут включать очень длинные цепи новой последовательности ДНК и / или тестировать целые библиотеки одновременно, в отличие от отдельных последовательностей. Эти сдвиги вносят сложность, которая требует от дизайна перехода от плоского представления, основанного на нуклеотидах, к более высокому уровню абстракции. Примерами таких инструментов являются GenoCAD , Teselagen [5] (бесплатно для академических кругов) или GeneticConstructor [6] (бесплатно для академических кругов).

Выбор организма-хозяина и вектора клонирования [ править ]

Схема широко используемой плазмиды для клонирования; pBR322 . Это круговой фрагмент ДНК длиной 4361 основание. Присутствуют два гена устойчивости к антибиотикам , придающие устойчивость к ампициллину и тетрациклину , а также начало репликации, которое хозяин использует для репликации ДНК.

Хотя используется очень большое количество организмов-хозяев и векторов молекулярного клонирования, подавляющее большинство экспериментов по молекулярному клонированию начинается с лабораторного штамма бактерии E. coli ( Escherichia coli ) и вектора клонирования плазмиды . E. coli и плазмидные векторы широко используются, поскольку они технически сложны, универсальны, широко доступны и обеспечивают быстрый рост рекомбинантных организмов с минимальным оборудованием. [3] Если ДНК, подлежащая клонированию, исключительно велика (от сотен тысяч до миллионов пар оснований), то часто выбирают бактериальную искусственную хромосому [10] или вектор искусственной хромосомы дрожжей .

Специализированные приложения могут потребовать специализированных векторных хост-систем. Например, если экспериментаторы хотят получить конкретный белок из рекомбинантного организма, тогда выбирается вектор экспрессии, который содержит соответствующие сигналы для транскрипции и трансляции в желаемом организме-хозяине. Альтернативно, если желательна репликация ДНК у разных видов (например, перенос ДНК от бактерий к растениям), тогда может быть выбран вектор из множества диапазонов хозяев (также называемый челночным вектором ). Однако на практике специализированные эксперименты по молекулярному клонированию обычно начинаются с клонирования в бактериальную плазмиду с последующим субклонированием в специализированный вектор.

Какая бы комбинация хозяина и вектора ни использовалась, вектор почти всегда содержит четыре сегмента ДНК, которые критически важны для его функции и экспериментальной полезности: [3]

  • Начало репликации ДНК необходимо для вектора (и связанных с ним рекомбинантных последовательностей) для репликации внутри организма-хозяина.
  • один или несколько уникальных сайтов узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые служат в качестве сайтов, в которые может быть введена чужеродная ДНК
  • выбираемый генетический маркер гена , который может быть использован для того, чтобы выживания клеток, занимаемые векторных последовательностей
  • тег ген , который может быть использован для скрининга клеток , содержащих чужеродную ДНК
Расщепление последовательности ДНК, содержащей сайт рестрикции BamHI . ДНК расщепляется по палиндромной последовательности с образованием «липких концов».

Подготовка векторной ДНК [ править ]

Вектор клонирования обрабатывают эндонуклеазой рестрикции для расщепления ДНК в том месте, куда будет вставлена ​​чужеродная ДНК. Рестрикционный фермент выбран для создания конфигурации в сайте расщепления, совместимой с концами чужеродной ДНК (см. Конец ДНК ). Обычно это делается путем расщепления векторной ДНК и чужеродной ДНК одним и тем же рестрикционным ферментом, например EcoRI . Большинство современных векторов содержат множество удобных сайтов расщепления, которые уникальны в пределах векторной молекулы (так что вектор может быть расщеплен только в одном сайте) и расположены внутри гена (часто бета-галактозидаза), инактивация которых может быть использована для отличия рекомбинантных организмов от нерекомбинантных на более позднем этапе процесса. Чтобы улучшить соотношение рекомбинантных и нерекомбинантных организмов, расщепленный вектор можно обработать ферментом ( щелочной фосфатазой ), который дефосфорилирует концы вектора. Векторные молекулы с дефосфорилированными концами не могут реплицироваться, и репликация может быть восстановлена ​​только в том случае, если чужеродная ДНК интегрирована в сайт расщепления. [11]

Подготовка ДНК для клонирования [ править ]

ДНК для клонирования чаще всего получают с помощью ПЦР . ДНК-матрица смешивается с основаниями (строительными блоками ДНК), праймерами (короткими фрагментами комплементарной одноцепочечной ДНК) и ферментом ДНК-полимеразой, который строит цепь ДНК. Смесь проходит циклы нагрева и охлаждения, чтобы произвести большое количество скопированной ДНК.

Для клонирования геномной ДНК клонируемую ДНК экстрагируют из интересующего организма. Можно использовать практически любой источник ткани (даже ткани вымерших животных ) [12], если ДНК не подвергается значительному разложению. Затем ДНК очищают с использованием простых методов для удаления загрязняющих белков (экстракция фенолом), РНК (рибонуклеаза) и более мелких молекул (осаждение и / или хроматография). Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) часто используются для амплификации конкретных последовательностей ДНК или РНК ( ОТ-ПЦР ) перед молекулярным клонированием.

ДНК для экспериментов по клонированию также может быть получена из РНК с использованием обратной транскриптазы ( комплементарная ДНК или клонирование кДНК) или в форме синтетической ДНК ( искусственный синтез генов ). Клонирование кДНК обычно используется для получения клонов, представляющих популяцию мРНК интересующих клеток, в то время как синтетическая ДНК используется для получения любой точной последовательности, определенной разработчиком. Такая сконструированная последовательность может потребоваться при перемещении генов по генетическим кодам (например, от митохрондрий к ядру) [13] или просто для увеличения экспрессии посредством оптимизации кодонов . [14]

Затем очищенную ДНК обрабатывают рестрикционным ферментом для получения фрагментов с концами, которые могут быть связаны с концами вектора. При необходимости короткие двухцепочечные сегменты ДНК ( линкеры ), содержащие желаемые сайты рестрикции, могут быть добавлены для создания концевых структур, совместимых с вектором. [3] [11]

Создание рекомбинантной ДНК с ДНК-лигазой [ править ]

The creation of recombinant DNA is in many ways the simplest step of the molecular cloning process. DNA prepared from the vector and foreign source are simply mixed together at appropriate concentrations and exposed to an enzyme (DNA ligase) that covalently links the ends together. This joining reaction is often termed ligation. The resulting DNA mixture containing randomly joined ends is then ready for introduction into the host organism.

DNA ligase only recognizes and acts on the ends of linear DNA molecules, usually resulting in a complex mixture of DNA molecules with randomly joined ends. The desired products (vector DNA covalently linked to foreign DNA) will be present, but other sequences (e.g. foreign DNA linked to itself, vector DNA linked to itself and higher-order combinations of vector and foreign DNA) are also usually present. This complex mixture is sorted out in subsequent steps of the cloning process, after the DNA mixture is introduced into cells.[3][11]

Introduction of recombinant DNA into host organism[edit]

Смесь ДНК, ранее обработанная in vitro, перемещается обратно в живую клетку, называемую организмом-хозяином. Методы, используемые для введения ДНК в клетки, разнообразны, и название, применяемое к этому этапу в процессе молекулярного клонирования, часто будет зависеть от выбранного экспериментального метода (например, трансформация , трансдукция , трансфекция , электропорация ). [3] [11]

Когда микроорганизмы способны поглощать и реплицировать ДНК из своей локальной среды, этот процесс называется трансформацией , а клетки, которые находятся в таком физиологическом состоянии, что они могут поглощать ДНК, считаются компетентными . [15] В культуре клеток млекопитающих аналогичный процесс введения ДНК в клетки обычно называют трансфекцией . Как трансформация, так и трансфекция обычно требуют подготовки клеток с помощью специального режима роста и процесса химической обработки, который будет варьироваться в зависимости от конкретных видов и типов клеток, которые используются.

Электропорация использует электрические импульсы высокого напряжения для перемещения ДНК через клеточную мембрану (и клеточную стенку, если таковая имеется). [16] Напротив, трансдукция включает упаковку ДНК в частицы, полученные из вируса, и использование этих вирусоподобных частиц для введения инкапсулированной ДНК в клетку посредством процесса, напоминающего вирусную инфекцию. Хотя электропорация и трансдукция являются узкоспециализированными методами, они могут быть наиболее эффективными методами перемещения ДНК в клетки.

Отбор организмов, содержащих векторные последовательности [ править ]

Какой бы метод ни использовался, введение рекомбинантной ДНК в выбранный организм-хозяин обычно является процессом с низкой эффективностью; то есть только небольшая часть клеток будет фактически принимать ДНК. Ученые-экспериментаторы решают эту проблему с помощью этапа искусственной генетической селекции, при котором клетки, которые не впитали ДНК, избирательно убиваются, и выживают только те клетки, которые могут активно реплицировать ДНК, содержащую селективный маркерный ген, кодируемый вектором. [3] [11]

Когда бактериальные клетки используются в качестве организмов-хозяев, селектируемый маркер обычно представляет собой ген, который придает устойчивость к антибиотику , который в противном случае убил бы клетки, обычно к ампициллину . Клетки, несущие плазмиду, выживут при воздействии антибиотика, в то время как те, которые не смогли принять плазмидные последовательности, погибнут. Когда используются клетки млекопитающих (например, клетки человека или мыши), используется аналогичная стратегия, за исключением того, что маркерный ген (в данном случае обычно кодируемый как часть кассеты kanMX ) придает устойчивость к антибиотику Geneticin .

Скрининг клонов с желаемыми ДНК-вставками и биологическими свойствами [ править ]

Современные бактериальные векторы для клонирования (например, pUC19 и более поздние производные, включая векторы pGEM) используют сине-белую систему скрининга, чтобы отличить колонии (клоны) трансгенных клеток от тех, которые содержат родительский вектор (то есть ДНК вектора без вставленной рекомбинантной последовательности). В этих векторах чужеродная ДНК вставлена ​​в последовательность, кодирующую существенную часть бета-галактозидазы., фермент, активность которого приводит к образованию колонии синего цвета на культуральной среде, которая используется для этой работы. Вставка чужеродной ДНК в последовательность, кодирующую бета-галактозидазу, отключает функцию фермента, так что колонии, содержащие трансформированную ДНК, остаются бесцветными (белыми). Таким образом, экспериментаторы могут легко идентифицировать и проводить дальнейшие исследования трансгенных бактериальных клонов, игнорируя при этом те, которые не содержат рекомбинантной ДНК.

Общую популяцию индивидуальных клонов, полученных в эксперименте по молекулярному клонированию, часто называют библиотекой ДНК . Библиотеки могут быть очень сложными (например, при клонировании полной геномной ДНК из организма) или относительно простыми (как при перемещении ранее клонированного фрагмента ДНК в другую плазмиду), но почти всегда необходимо исследовать несколько различных клонов, чтобы быть уверенным. что желаемая конструкция ДНК получена. Это может быть достигнуто с помощью очень широкого диапазона экспериментальных методов, включая использование гибридизации нуклеиновых кислот , зондов антител , полимеразной цепной реакции , анализа рестрикционных фрагментов и / или секвенирования ДНК . [3] [11]

Applications[edit]

Molecular cloning provides scientists with an essentially unlimited quantity of any individual DNA segments derived from any genome. This material can be used for a wide range of purposes, including those in both basic and applied biological science. A few of the more important applications are summarized here.

Genome organization and gene expression[edit]

Molecular cloning has led directly to the elucidation of the complete DNA sequence of the genomes of a very large number of species and to an exploration of genetic diversity within individual species, work that has been done mostly by determining the DNA sequence of large numbers of randomly cloned fragments of the genome, and assembling the overlapping sequences.

At the level of individual genes, molecular clones are used to generate probes that are used for examining how genes are expressed, and how that expression is related to other processes in biology, including the metabolic environment, extracellular signals, development, learning, senescence and cell death. Cloned genes can also provide tools to examine the biological function and importance of individual genes, by allowing investigators to inactivate the genes, or make more subtle mutations using regional mutagenesis or site-directed mutagenesis. Genes cloned into expression vectors for functional cloning provide a means to screen for genes on the basis of the expressed protein's function.

Производство рекомбинантных белков [ править ]

Получение молекулярного клона гена может привести к развитию организмов, которые продуцируют белковый продукт клонированных генов, называемый рекомбинантным белком. На практике зачастую сложнее разработать организм, который продуцирует активную форму рекомбинантного белка в желаемых количествах, чем клонировать ген. Это связано с тем, что молекулярные сигналы для экспрессии генов сложны и вариабельны, а также потому, что сворачивание, стабильность и транспорт белков могут быть очень сложными.

Многие полезные белки в настоящее время доступны в виде рекомбинантных продуктов . Они включают в себя - (1) с медицинской точки зрения полезные белки, администрация может исправить дефектный или плохо выраженный ген (например , рекомбинантный фактор VIII , кровь-фактор свертывания крови с дефицитом в некоторых формах гемофилии , [17] и рекомбинантный инсулин , используемый для лечения некоторых форм от диабета [18] ), (2) белки , которые могут быть введены , чтобы помочь в угрожающей жизни чрезвычайной ситуации (например , тканевый активатор плазминогена , используется для лечения инсультов [19]), (3) рекомбинантные субъединичные вакцины, в которых очищенный белок можно использовать для иммунизации пациентов от инфекционных заболеваний, не подвергая их воздействию самого инфекционного агента (например, вакцина против гепатита B [20] ), и (4) рекомбинантные белки в качестве стандарта. материал для диагностических лабораторных исследований.

Трансгенные организмы [ править ]

После характеризации и обработки для обеспечения сигналов для соответствующей экспрессии клонированные гены могут быть вставлены в организмы, генерируя трансгенные организмы, также называемые генетически модифицированными организмами (ГМО). Хотя большинство ГМО генерируются для целей фундаментальных биологических исследований (см., Например, трансгенные мыши ), ряд ГМО был разработан для коммерческого использования, начиная от животных и растений, производящих фармацевтические препараты или другие соединения ( фарминг ), и растений, устойчивых к гербицидам. растения и флуоресцентные тропические рыбки ( GloFish ) для домашних развлечений. [1]

Генная терапия [ править ]

Генная терапия включает введение функционального гена в клетки, лишенные этой функции, с целью исправления генетического нарушения или приобретенного заболевания. Генную терапию можно условно разделить на две категории. Первый - это изменение половых клеток, то есть сперматозоидов или яйцеклеток, которое приводит к постоянным генетическим изменениям для всего организма и последующих поколений. Многие считают эту «генную терапию зародышевой линии» неэтичной для людей. [21]Второй тип генной терапии, «генная терапия соматических клеток», аналогичен трансплантации органов. В этом случае одна или несколько конкретных тканей подвергаются прямому лечению или удалению ткани, добавлению терапевтического гена или генов в лаборатории и возвращению обработанных клеток пациенту. Клинические испытания генной терапии соматических клеток начались в конце 1990-х годов, в основном для лечения рака и заболеваний крови, печени и легких. [22]

Despite a great deal of publicity and promises, the history of human gene therapy has been characterized by relatively limited success.[22] The effect of introducing a gene into cells often promotes only partial and/or transient relief from the symptoms of the disease being treated. Some gene therapy trial patients have suffered adverse consequences of the treatment itself, including deaths. In some cases, the adverse effects result from disruption of essential genes within the patient's genome by insertional inactivation. In others, viral vectors used for gene therapy have been contaminated with infectious virus. Nevertheless, gene therapy is still held to be a promising future area of medicine, and is an area where there is a significant level of research and development activity.

References[edit]

  1. ^ a b Watson JD (2007). Recombinant DNA: genes and genomes: a short course. San Francisco: W.H. Freeman. ISBN 978-0-7167-2866-5.
  2. ^ Patten CL, Glick BR, Pasternak J (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington, D.C: ASM Press. ISBN 978-1-55581-498-4.
  3. ^ a b c d e f g h Brown T (2006). Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 978-1-4051-1121-8.
  4. ^ M., Grisham, Charles (2013-01-01). Biochemistry. Brooks/Cole, Cengage Learning. ISBN 978-1133106296. OCLC 777722371.
  5. ^ Garret, Grisham (2010). Biochemistry. Belmont, CA, Brooks/Cole: Cengage Learning. p. 380.
  6. ^ Nathans D, Smith HO (1975). "Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of dna molecules". Annual Review of Biochemistry. 44: 273–93. doi:10.1146/annurev.bi.44.070175.001421. PMID 166604.
  7. ^ Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (Nov 1973). "Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (11): 3240–4. Bibcode:1973PNAS...70.3240C. doi:10.1073/pnas.70.11.3240. PMC 427208. PMID 4594039.
  8. ^ Jackson DA, Symons RH, Berg P (Oct 1972). "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10): 2904–9. Bibcode:1972PNAS...69.2904J. doi:10.1073/pnas.69.10.2904. PMC 389671. PMID 4342968.
  9. ^ "plasmid / plasmids | Learn Science at Scitable". www.nature.com. Retrieved 2017-12-06.
  10. ^ Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (Sep 1992). "Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (18): 8794–7. Bibcode:1992PNAS...89.8794S. doi:10.1073/pnas.89.18.8794. PMC 50007. PMID 1528894.
  11. ^ a b c d e f Russell DW, Sambrook J (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 978-0-87969-576-7.
  12. ^ Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder OA, Wilson AC (1984). "DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family". Nature. 312 (5991): 282–4. Bibcode:1984Natur.312..282H. doi:10.1038/312282a0. PMID 6504142. S2CID 4313241.
  13. ^ Boominathan, A; Vanhoozer, S; Basisty, N; Powers, K; Crampton, AL; Wang, X; Friedricks, N; Schilling, B; Brand, MD; O'Connor, MS (2 November 2016). "Stable nuclear expression of ATP8 and ATP6 genes rescues a mtDNA Complex V null mutant". Nucleic Acids Research. 44 (19): 9342–9357. doi:10.1093/nar/gkw756. PMC 5100594. PMID 27596602.
  14. ^ Plotkin, J. B.; Kudla, G (2011). "Synonymous but not the same: The causes and consequences of codon bias". Nature Reviews Genetics. 12 (1): 32–42. doi:10.1038/nrg2899. PMC 3074964. PMID 21102527.
  15. ^ Lederberg J (Feb 1994). "The transformation of genetics by DNA: an anniversary celebration of Avery, MacLeod and McCarty (1944)". Genetics. 136 (2): 423–6. PMC 1205797. PMID 8150273.
  16. ^ Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (Mar 1989). "Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation". Molecular & General Genetics. 216 (1): 175–7. doi:10.1007/BF00332248. PMID 2659971. S2CID 25214157.
  17. ^ Oldenburg J, Dolan G, Lemm G (Jan 2009). "Haemophilia care then, now and in the future". Haemophilia. 15 Suppl 1: 2–7. doi:10.1111/j.1365-2516.2008.01946.x. PMID 19125934. S2CID 29118026.
  18. ^ The MJ (Nov 1989). "Human insulin: DNA technology's first drug". American Journal of Hospital Pharmacy. 46 (11 Suppl 2): S9-11. PMID 2690608.
  19. ^ Lewandowski C, Barsan W (Feb 2001). "Treatment of acute ischemic stroke". Annals of Emergency Medicine. 37 (2): 202–16. doi:10.1067/mem.2001.111573. PMID 11174240.
  20. ^ Chang MH, Chen CJ, Lai MS, Hsu HM, Wu TC, Kong MS, Liang DC, Shau WY, Chen DS (Jun 1997). "Universal hepatitis B vaccination in Taiwan and the incidence of hepatocellular carcinoma in children. Taiwan Childhood Hepatoma Study Group". The New England Journal of Medicine. 336 (26): 1855–9. doi:10.1056/NEJM199706263362602. PMID 9197213.
  21. ^ August JT (1997). Gene Therapy. 40. Academic Press. p. 508. ISBN 978-0-08-058132-3.
  22. ^ a b Pfeifer A, Verma IM (2001). "Gene therapy: promises and problems". Annual Review of Genomics and Human Genetics. 2: 177–211. doi:10.1146/annurev.genom.2.1.177. PMID 11701648.

Further reading[edit]

  • Matsumura, Ichiro (September 2015). "Why Johnny can't clone: Common pitfalls and not so common solutions". BioTechniques. 53 (3): IV–XIII. doi:10.2144/000114324. PMID 26345511. Retrieved 2 February 2016.

External links[edit]

Library resources about
Molecular cloning
  • Resources in your library
  • Resources in other libraries
  • Media related to Molecular cloning at Wikimedia Commons