Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Чтобы узнать о других значениях, см. Вектор .

В молекулярном клонировании , А вектор представляет собой молекула ДНК , используемая в качестве средства для искусственного несут чужеродный генетический материал в другую ячейку , где она может быть воспроизведена и / или выраженной (например, плазмиды , космидная , лямбда - фаги ). Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК . Четыре основных типа векторов - это плазмиды , вирусные векторы , космиды и искусственные хромосомы . Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды. [1] Общие для всех сконструированных векторов имеютисточник репликации , сайт многоклонирования и селективный маркер .

Сам вектор обычно представляет собой последовательность ДНК , которая состоит из вставки ( трансгена ) и более крупной последовательности, которая служит «основой» вектора. Цель вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, обычно состоит в том, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в целевой клетке. Все векторы могут быть использованы для клонирования и, следовательно, являются векторами клонирования , но есть также векторы, разработанные специально для клонирования, тогда как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белков. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в клетке-мишени, называются векторами экспрессии и обычно имеют промотор.последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в клетке-мишени, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для усиления их вставки.

Манипуляции с ДНК обычно проводят с векторами E. coli , которые содержат элементы, необходимые для их поддержания в E. coli . Однако векторы могут также иметь элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме, таком как клетки дрожжей, растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами . Такие векторы содержат бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть перенесены в небактериальный организм-хозяин, однако другие векторы, называемые внутригенными векторами, также были разработаны, чтобы избежать переноса любого генетического материала от чужеродных видов. [2]

Вставка вектора в клетку - мишень обычно называют преобразование для бактериальных клеток, [3] трансфекции для эукариотических клеток , [4] , хотя введение вирусного вектора часто называют трансдукции . [5]

Характеристики [ править ]

Плазмиды [ править ]

Основная статья: плазмидный вектор

Плазмиды представляют собой двухцепочечные внехромосомные и, как правило, кольцевые последовательности ДНК, способные к репликации с использованием репликационного аппарата клетки-хозяина. [6] Плазмидные векторы минималистично состоят из точки начала репликации, которая делает возможной полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко обнаружены у многих бактерий, например, у Escherichia coli , но также могут быть обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae . [7] Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными / трансмиссивными и неконъюгативными:

  • конъюгативный - опосредует перенос ДНК посредством конъюгации и, следовательно, быстро распространяется среди бактериальных клеток популяции; например, плазмида F, многие плазмиды R и некоторые col.
  • неконъюгативные - не опосредуют ДНК посредством конъюгации, например, многие плазмиды R и col.
PBR322 плазмида является одним из первых плазмид , широко используемых в качестве вектора клонирования .

Плазмиды со специально сконструированными функциями обычно используются в лабораториях для целей клонирования . Эти плазмиды обычно неконъюгативны, но могут иметь гораздо больше функций, в частности « сайт множественного клонирования », где множественные сайты расщепления рестрикционными ферментами позволяют встраивать вставку трансгена. Бактерии, содержащие плазмиды, могут генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий за часы, а амплифицированные векторы могут быть извлечены из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды можно использовать конкретно в качестве векторов транскрипции, и в таких плазмидах могут отсутствовать важные последовательности для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белков, называемые векторами экспрессии., будет включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы , стартовый и стоп-кодоны .

Вирусные векторы [ править ]

Основная статья: Вирусный вектор

Вирусные векторы, как правило, представляют собой генно-инженерные вирусы, несущие модифицированные вирусные ДНК или РНК, которые были признаны неинфекционными, но все же содержат вирусные промоторы, а также трансген, что позволяет осуществлять трансляцию трансгена через вирусный промотор. Однако, поскольку вирусные векторы часто лишены инфекционных последовательностей, им требуются вспомогательные вирусы или упаковочные линии для крупномасштабной трансфекции. Вирусные векторы часто предназначены для постоянного включения вставки в геном хозяина и, таким образом, оставляют различные генетические маркеры в геноме хозяина после включения трансгена. Например, ретровирусы оставляют характерную ретровирусную интеграцию. паттерн после вставки, который поддается обнаружению и указывает на то, что вирусный вектор встроен в геном хозяина.

Искусственные хромосомы [ править ]

Основная статья: Искусственная хромосома (значения)

Искусственные хромосомы - это искусственные хромосомы дрожжей (YAC), бактериальные искусственные хромосомы (BAC) или искусственные хромосомы человека (HAC). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы. [8] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурных необходимости искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и концевые последовательности теломеров. [9]

Транскрипция [ править ]

Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для создания множества копий мРНК , матрицы, на которой белок может быть получен посредством трансляции. [10] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, а количество генерируемых копий мРНК зависит от промотора, используемого в векторе. [11] Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок постоянно продуцируется в фоновом режиме, или может быть индуцибельной, в результате чего белок экспрессируется только при определенных условиях, например, при добавлении химического индуктора. Эти два разных типа экспрессии зависят от типов промотора ииспользуемый оператор .

Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно вызывают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах. [12] Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мыши инициирует транскрипцию только после нанесения дексаметазона, а промотор теплового шока Drosophilia инициируется только после высоких температур.

Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например для производства мРНК in vitro . Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для продукции белка.

Выражение [ править ]

Основная статья: Вектор экспрессии

Векторы экспрессии производить белки через транскрипцию вставки этого вектора с последующим переводом из мРНК производства, поэтому они требуют больше компонентов , чем более простых транскрипционных только векторы. Для экспрессии в разных организмах-хозяевах потребуются разные элементы, хотя они имеют схожие требования, например промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и сигналы терминации.

Вектор экспрессии прокариот [ править ]

  • Промотор - обычно используемые индуцибельные промоторы представляют собой промоторы, полученные из оперона lac и промотора Т7 . Другие сильные промоторы включают в себя используемые Trp - промотор и Tac-Promoter , которые представляют собой гибрид обоих промоторов Trp и Лак Operon.
  • Сайт связывания рибосомы (RBS) - следует за промотором и способствует эффективной трансляции интересующего белка.
  • Сайт инициации трансляции - последовательность Шайна-Дальгарно, заключенная в RBS, 8 пар оснований перед стартовым кодоном AUG.

Вектор экспрессии эукариот [ править ]

Для векторов экспрессии эукариот требуются последовательности, кодирующие:

  • Хвост полиаденилирования: создает хвост полиаденилирования на конце транскрибируемой пре-мРНК, который защищает мРНК от экзонуклеаз и обеспечивает терминацию транскрипции и трансляции: стабилизирует продукцию мРНК.
  • Минимальная UTR длина: НТО содержат специфические характеристики , которые могут препятствовать транскрипции или трансляции, и таким образом самые короткие НТО или вообще кодируются для в оптимальных векторов экспрессии.
  • Последовательность Козака : векторы должны кодировать последовательность Козака в мРНК, которая собирает рибосому для трансляции мРНК.

Особенности [ править ]

Современные искусственно созданные векторы содержат важные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, обнаруженные только в некоторых векторах:

  • Источник репликации : необходим для репликации и поддержания вектора в клетке-хозяине.
  • Промотор : промоторы используются для управления транскрипцией трансгена вектора, а также других генов в векторе, таких как ген устойчивости к антибиотикам. Некоторые клонирующие векторы не обязательно должны иметь промотор для клонированной вставки, но он является важным компонентом векторов экспрессии, так что клонированный продукт может быть экспрессирован.
  • Сайт клонирования: это может быть сайт множественного клонирования или другие функции, которые позволяют вставлять чужеродную ДНК в вектор посредством лигирования .
  • Генетические маркеры : генетические маркеры для вирусных векторов позволяют подтвердить, что вектор интегрирован с геномной ДНК хозяина.
  • Устойчивость к антибиотикам : векторы с открытыми рамками считывания устойчивости к антибиотикам позволяют выжить клеткам, которые поглотили вектор в питательной среде, содержащей антибиотики, путем отбора антибиотиков.
  • Эпитоп : некоторые векторы могут содержать последовательность для конкретного эпитопа, который может быть включен в экспрессируемый белок. Это позволяет идентифицировать антитела к клеткам, экспрессирующим целевой белок.
  • Репортерные гены : некоторые векторы могут содержать репортерный ген, позволяющий идентифицировать плазмиду, содержащую встроенную последовательность ДНК. Примером является lacZ-α, который кодирует N-концевой фрагмент β-галактозидазы , фермента, переваривающего галактозу . Сайт множественного клонирования расположен внутри lacZ-α , и вставка, успешно лигированная в вектор, нарушит последовательность гена, что приведет к неактивной β-галактозидазе. Клетки, содержащие вектор со вставкой, могут быть идентифицированы с использованием синего / белого отбора путем выращивания клеток в среде, содержащей аналог галактозы ( X-gal). Клетки, экспрессирующие β-галактозидазу (поэтому не содержат вставки), выглядят как синие колонии. Белые колонии будут выбраны как те, которые могут содержать вставку. Другие широко используемые репортеры включают зеленый флуоресцентный белок и люциферазу .
  • Направляющая последовательность: векторы экспрессии могут включать кодирование нацеливающей последовательности в готовом белке, которая направляет экспрессируемый белок к определенной органелле в клетке или конкретному месту, например периплазматическому пространству бактерий.
  • Теги очистки белков : некоторые векторы экспрессии включают последовательности белков или пептидов, которые позволяют упростить очистку экспрессируемого белка. Примеры включают полигистидиновую метку , глутатион-S-трансферазу и белок, связывающий мальтозу . Некоторые из этих тегов могут также способствовать повышению растворимости целевого белка. Целевой белок сливается с белковой меткой, но сайт расщепления протеазой, расположенный в области полипептидного линкера между белком и меткой, позволяет удалить метку позже.

См. Также [ править ]

  • Плазмида
  • Вирусный вектор
  • Клонирование вектора
  • Вектор выражения
  • Гибридный вектор
  • Миникруг
  • Рекомбинантная ДНК
  • Голая ДНК
  • Вектор (эпидемиология) , организм, передающий болезнь
  • Искусственные хромосомы человека
  • Искусственные хромосомы дрожжей
  • Бактериальные искусственные хромосомы
  • ДНК-вакцинация

Ссылки [ править ]

  1. ^ Лодиш Н, Берк А, Zipursky SL, Мацудаира Р, Балтимор D, Дарнелл J (2000). «Клонирование ДНК с плазмидными векторами» . Молекулярная клеточная биология (4-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman.
  2. ^ Acquaah G (16 августа 2012). Принципы генетики и селекции растений . ISBN компании John Wiley & Sons Inc. 978-1-118-31369-5.
  3. ^ Джонстон C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP (март 2014). «Бактериальная трансформация: распространение, общие механизмы и дивергентный контроль». Обзоры природы. Микробиология . 12 (3): 181–96. DOI : 10.1038 / nrmicro3199 . PMID 24509783 . S2CID 23559881 .  
  4. ^ "MeSH Browser" . meshb.nlm.nih.gov . Проверено 16 апреля 2018 .
  5. ^ Hartl DL, Джонс EW (1998). Генетика: принципы и анализ (4-е изд.). Садбери, Массачусетс: издательство "Джонс и Бартлетт". ISBN 978-0-7637-0489-6. OCLC  45730915 .
  6. ^ дель Солар, Глория; Хиральдо, Рафаэль; Руис-Эчеваррия, Мария Хесус; Эспиноза, Мануэль; Диас-Орехас, Рамон (июнь 1998 г.). "Репликация и контроль циркулярных бактериальных плазмид" . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 62 (2): 434–464. DOI : 10.1128 / MMBR.62.2.434-464.1998 . ISSN 1092-2172 . PMC 98921 . PMID 9618448 .   
  7. Перейти ↑ Brown TA (2010). «Глава 2 - Векторы для клонирования генов: плазмиды и бактериофаги» . Клонирование генов и анализ ДНК: Введение (6-е изд.). Вили-Блэквелл. ISBN 978-1-4051-8173-0.
  8. ^ Джулин, Дуглас (2014). «Искусственные хромосомы». Молекулярные науки о жизни . Спрингер, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. С. 1–3. DOI : 10.1007 / 978-1-4614-6436-5_91-3 . ISBN 978-1-4614-6436-5.
  9. ^ Мюррей, Эндрю; Шостак, Джек (ноябрь 1987 г.). «Искусственные хромосомы». Scientific American . 257 (5): 62–68. Bibcode : 1987SciAm.257e..62M . DOI : 10.1038 / Scientificamerican1187-62 . PMID 3317814 . 
  10. ^ Соломон EP, Берг LR, Мартин DW (2005). Биология (8-е изд.). Бельмонт, Калифорния: Обучение Брукса / Коула Томсона. ISBN 978-0-495-31714-2. OCLC  123008833 .
  11. ^ Damdindorj л, Karnan S, От А, Е Хоссаины, Конисуйте Y, Хосокав Y, Конисуйте Н (2014-08-29). «Сравнительный анализ конститутивных промоторов, расположенных в аденоассоциированных вирусных векторах» . PLOS ONE . 9 (8): e106472. Bibcode : 2014PLoSO ... 9j6472D . DOI : 10.1371 / journal.pone.0106472 . PMC 4149579 . PMID 25170953 .  
  12. ^ Левина А, Майер М, Chusainow Дж, Якоб Д, Аппель В (июне 2005 г.). «Вирусные промоторы могут инициировать экспрессию генов токсинов, введенных в Escherichia coli» . BMC Biotechnology . 5 : 19. DOI : 10,1186 / 1472-6750-5-19 . PMC 1181807 . PMID 15967027 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Freshney IR (29 июля 2005 г.). Культура клеток животных: руководство по базовой технике . Хобокен, Нью-Джерси: ISBN John Wiley & Sons, Inc. 978-0-471-45329-1.

Внешние ссылки [ править ]

  • Введение ученых Ваксмана в векторы
  • Сравнение векторов, используемых для клинического переноса генов
  • Группа транспорта генов