Сайт множественного клонирования ( MCS ), также называемый полилинкером , короткий сегмент ДНК , который содержит множество (до \ 20) сайтов рестрикции - стандартная функция сконструированных плазмид . [1] Сайты рестрикции в MCS обычно уникальны и встречаются только один раз в данной плазмиде. Цель MCS в плазмиде - позволить фрагменту ДНК быть вставленным в эту область. [2] MCS обнаруживается во множестве векторов, включая векторы клонирования для увеличения количества копий целевой ДНК, и в векторах экспрессии для создания белкового продукта. [3]В векторах экспрессии MCS располагается ниже промотора . [2]
Создание сайта множественного клонирования [ править ]
В некоторых случаях вектор может не содержать MCS. Скорее, к вектору можно добавить MCS. [4] Первым шагом является создание комплементарных олигонуклеотидных последовательностей, которые содержат сайты рестрикционных ферментов вместе с дополнительными основаниями на конце, которые комплементарны вектору после переваривания. Затем олигонуклеотидные последовательности могут быть отожжены и лигированы в расщепленный и очищенный вектор. Переваренный вектор разрезают рестрикционным ферментом, который дополняет выступающие части олигонуклеотидной вставки. После лигирования трансформируйте вектор в бактерии и проверьте вставку путем секвенирования. Этот метод также можно использовать для добавления новых сайтов ограничения к сайту множественного клонирования.
Использует [ редактировать ]
Множественные сайты клонирования - это функция, которая позволяет вставлять чужеродную ДНК без нарушения остальной плазмиды, что делает ее чрезвычайно полезной в биотехнологии , биоинженерии и молекулярной генетике . [1] MCS может помочь в создании трансгенных организмов, более известных как генетически модифицированный организм (ГМО), с использованием генной инженерии. Чтобы воспользоваться преимуществами MCS в генной инженерии, интересующий ген должен быть добавлен к вектору во время производства, когда MCS разрезан. [5]После создания и лигирования MCS он будет включать интересующий ген и может быть амплифицирован для увеличения числа копий гена в бактерии-хозяине. После репликации бактерии интересующий ген может быть извлечен из бактерии. В некоторых случаях вектор экспрессии можно использовать для создания белкового продукта. После того, как продукты изолированы, их можно использовать в самых разных сферах, таких как производство инсулина , создание вакцин , производство антибиотиков и создание генной терапии.
Пример [ править ]
Одна бактериальная плазмида, используемая в генной инженерии в качестве вектора клонирования плазмиды, - это pUC18. Его полилинкерная область состоит из нескольких сайтов узнавания рестрикционных ферментов, которые были сконструированы в единый кластер (полилинкер). Он имеет сайты рестрикции для различных ферментов рестрикции, включая EcoRI , BamHI и PstI . Другой вектор, используемый в генной инженерии, - это pUC19 , который похож на pUC18, но его полилинкерная область является обратной. E.coli также часто используется в качестве бактериального хозяина из-за доступности, быстрой скорости роста и универсальности. [6]
Первым шагом для генетической инженерии инсулина является разрезание MCS в используемой плазмиде. [7] После разрезания MCS можно добавить ген человеческого инсулина, сделав плазмиду генетически модифицированной. После этого генетически модифицированная плазмида помещается в бактериальный хозяин и дается возможность делиться. Чтобы обеспечить необходимый запас, клетки-хозяева помещают в большой резервуар для ферментации, который является оптимальной средой для хозяина. Процесс завершается отфильтровыванием инсулина от хозяина. Затем можно произвести очистку, чтобы инсулин можно было упаковать и распределить среди людей с диабетом.
Ссылки [ править ]
- ^ a b Кларк Д.П. (2005). Молекулярная биология . Академическая пресса. п. 611. ISBN 0-12-175551-7.
- ^ a b "Addgene: Что такое плазмид?" . www.addgene.org . Проверено 29 апреля 2018 .
- ^ Картер, Ши, Мэтт, Дженнифер (2015). Руководство по методам исследования в неврологии . Эльзевир. С. 219–237.
- ^ «Как создать идеальный MCS» (PDF) . Addgene . 2018-04-28.
- ^ «BBC - Биология Bitesize Standard Grade - Перепрограммирование микробов: пересмотр, стр. 2» . Проверено 29 апреля 2018 .
- ^ "Инструменты генной инженерии | Безграничная микробиология" . course.lumenlearning.com . Проверено 29 апреля 2018 .
- ^ "Что такое генная инженерия?" . Проверено 29 апреля 2018 .
