Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Септины S. cerevisiae, выявленные с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентного мечения

В области молекулярной биологии и биотехнологии , A флуоресцентные метки , также известные как флуоресцентная метка или флуоресцентный зонд , представляют собой молекула , которая присоединена к химически помощи в обнаружении биомолекул , такие как белки, антитело, или аминокислоте. Как правило, флуоресцентная маркировка или маркировка использует реактивное производное флуоресцентной молекулы, известное как флуорофор . Флуорофор селективно связывается с определенной областью или функциональной группой на молекуле-мишени и может быть присоединен химически или биологически. [1] Различные методы маркировки, такие как ферментативная маркировка,маркировка белков и генетическая маркировка широко используются. Бромид этидия , флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок являются общими метками. Наиболее часто меченые молекулы - это антитела, белки, аминокислоты и пептиды, которые затем используются в качестве специфических зондов для обнаружения конкретной мишени. [2]

История [ править ]

Стоукс Джордж Дж.
Осаму Шимомура-пресс-конференция 6 декабря 2008-1

Разработка методов обнаружения и идентификации биомолекул была мотивирована возможностью улучшить изучение молекулярной структуры и взаимодействий. До появления флуоресцентного мечения радиоизотопы использовались для обнаружения и идентификации молекулярных соединений. С тех пор были разработаны более безопасные методы, которые включают использование флуоресцентных красителей или флуоресцентных белков в качестве меток или зондов в качестве средства для мечения и идентификации биомолекул. [3] Хотя флуоресцентное мечение в этом отношении использовалось только недавно, открытие флуоресценции происходит гораздо дольше.

Сэр Джордж Стокс разработал закон флуоресценции Стокса в 1852 году, согласно которому длина волны флуоресцентного излучения больше, чем длина волны возбуждающего излучения. Ричард Мейер затем назвал флуорофор в 1897 году, чтобы описать химическую группу, связанную с флуоресценцией. С тех пор флуоресцеин был создан Адольфом фон Байером в качестве флуоресцентного красителя в 1871 году, а метод окрашивания был разработан и использован с развитием флуоресцентной микроскопии в 1911 году [4].

Бромид этидия и его варианты были разработаны в 1950-х годах [4], а в 1994 году были введены флуоресцентные белки или FP. [5] Зеленый флуоресцентный белок, или GFP, был открыт Осаму Шимомурой в 1960-х годах и был разработан как индикаторная молекула Дугласом Прашером в 1987 году. [6] FP привели к прорыву в визуализации живых клеток с возможностью выборочной маркировки участков генетического белка. и наблюдать функции и механизмы белков. [5] За этот прорыв Шимомура был удостоен Нобелевской премии в 2008 году. [7]

Были разработаны новые методы отслеживания биомолекул, включая использование колориметрических биосенсоров, фотохромных соединений, биоматериалов и электрохимических сенсоров. Флуоресцентная маркировка также является распространенным методом, в котором применяется ферментативная маркировка, химическая маркировка, маркировка белков и генетическая маркировка. [1]

Типы биосенсоров

Методы отслеживания биомолекул [ править ]

В настоящее время существует несколько методов маркировки для отслеживания биомолекул. Некоторые из методов включают следующее.

Маркеры изотопов [ править ]

Обычные виды, для которых используются изотопные маркеры, включают белки. В этом случае аминокислоты со стабильными изотопами углерода, азота или водорода включаются в полипептидные последовательности. [8] Эти полипептиды затем подвергаются масс-спектрометрии . Благодаря точно определенному изменению, которое эти изотопы вызывают в пептидах, по графику спектрометрии можно определить, какие пептиды содержат изотопы. Таким образом можно извлечь интересующий белок из нескольких других в группе. Изотопные соединения играют важную роль в качестве фотохромов, описанных ниже.

Колориметрические биосенсоры [ править ]

Биосенсоры прикрепляются к интересующему веществу. Обычно это вещество не может поглощать свет, но с присоединенным биосенсором свет может поглощаться и испускаться на спектрофотометре . [9] Кроме того, флуоресцентные биосенсоры можно увидеть невооруженным глазом. Некоторые флуоресцентные биосенсоры также могут изменять цвет в изменяющейся среде (например, с синего на красный). Исследователь сможет исследовать и получать данные об окружающей среде на основе того, какой цвет он или она может видеть визуально у гибридных видов биосенсора и молекулы. [10]

Колориметрические анализы обычно используются для определения того, какова концентрация одного вида по сравнению с другим. [9]

Фотохромные соединения [ править ]

Фотохромные соединения обладают способностью переключаться между диапазоном или множеством цветов. Их способность отображать разные цвета зависит от того, как они поглощают свет. Различные изомерные проявления молекулы поглощают свет с разной длиной волны, так что каждый изомерный вид может отображать свой цвет в зависимости от своего поглощения. К ним относятся соединения с фотопереключением, которые представляют собой белки, которые могут переключаться из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное в определенных условиях. [11]

Наиболее распространенной органической молекулой, используемой в качестве фотохрома, является диарилетен . [12] Другие примеры фотосопереключаемых белков включают PADRON-C, rs-FastLIME-s и bs-DRONPA-s, которые можно использовать как в клетках растений, так и в клетках млекопитающих, чтобы наблюдать, как клетки перемещаются в различные среды. [11]

Биоматериалы [ править ]

Флуоресцентные биоматериалы - это возможный способ использования внешних факторов для более заметного наблюдения за ходом пути. Метод включает флуоресцентное маркирование пептидных молекул, которые могут изменить естественный путь организма. Когда этот пептид вводится в клетку организма, он может вызвать другую реакцию. Этот метод можно использовать, например, для лечения пациента, а затем наглядно увидеть результат лечения. [13]

Электрохимические датчики [ править ]

Электрохимические датчики могут использоваться для определения биомолекул без маркировки. Они обнаруживают изменения и измеряют ток между исследуемым металлическим электродом и электролитом, содержащим целевой аналит. Затем к электроду прикладывается известный потенциал из тока обратной связи, и результирующий ток может быть измерен. Например, один метод с использованием электрохимического зондирования включает медленное повышение напряжения, вызывающее окисление или восстановление химических веществ на электроде. График зависимости тока ячейки от напряжения позволяет в конечном итоге определить количество химических веществ, потребляемых или производимых на электроде. [14] Флуоресцентные метки могут использоваться вместе с электрохимическими датчиками для облегчения обнаружения в биологической системе.

Флуоресцентные метки [ править ]

Aequorea victoria
Структура GFP

Из различных методов мечения биомолекул флуоресцентные метки имеют преимущество в том, что они очень чувствительны даже при низкой концентрации и не разрушают складывание и функцию молекулы-мишени. [1]

Зеленый флуоресцентный белок - это встречающийся в природе флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria, который широко используется для маркировки представляющих интерес белков. GFP излучает фотон в зеленой области светового спектра при возбуждении за счет поглощения света. Хромофор состоит из окисленного трипептида -Ser ^ 65-Тир ^ 66-Кли ^ 67 , расположенный в пределах беты барреля. GFP катализирует окисление и требует только молекулярного кислорода. GFP был изменен путем изменения длины волны поглощаемого света, чтобы включить другие цвета флуоресценции. YFP или желтый флуоресцентный белок , BFP или синий флуоресцентный белок и CFP или голубой флуоресцентный белокявляются примерами вариантов GFP. Эти варианты получены с помощью генной инженерии гена GFP. [15]

Синтетические флуоресцентные зонды также можно использовать в качестве флуоресцентных меток. Преимущества этих этикеток включают меньший размер и большее разнообразие цветов. Их можно использовать для более селективной маркировки представляющих интерес белков с помощью различных методов, включая маркировку на основе химического распознавания, такую ​​как использование хелатирующих металлы пептидных меток и маркировку на основе биологического распознавания с использованием ферментативных реакций. [16] Однако, несмотря на широкий спектр длин волн возбуждения и излучения, а также лучшую стабильность, синтетические зонды имеют тенденцию быть токсичными для клетки и поэтому обычно не используются в исследованиях визуализации клеток. [1]

Флуоресцентные метки можно гибридизировать с мРНК, чтобы помочь визуализировать взаимодействие и активность, например локализацию мРНК. Антисмысловая цепь, помеченная флуоресцентным зондом, присоединяется к одной цепи мРНК, и затем ее можно рассматривать во время развития клетки, чтобы увидеть движение мРНК внутри клетки. [17]

Флуорогенные этикетки [ править ]

Флуороген - это лиганд (флуорогенный лиганд), который сам по себе не является флуоресцентным, но когда он связан определенным белком или структурой РНК, становится флуоресцентным. [18]

Например, FAST представляет собой вариант фотоактивного желтого белка, который был сконструирован для связывания химических имитаторов трипептидного хромофора GFP. [19] Аналогичным образом, аптамер шпината представляет собой сконструированную последовательность РНК, которая может связывать химические имитаторы хромофора GFP, тем самым обеспечивая условную и обратимую флуоресценцию молекулам РНК, содержащим последовательность. [20]

Использование тегов в флуоресцентной маркировке [ править ]

В прямом тесте на флуоресцентные антитела антитела были химически связаны с флуоресцентным красителем.
FISH-изображение бифидобактерий Cy3
FISH анализ синдром ди Джорджа

Флуоресцентная маркировка известна своей неразрушающей природой и высокой чувствительностью. Это сделало его одним из наиболее широко используемых методов маркировки и отслеживания биомолекул. [1] В зависимости от природы мишени можно использовать несколько методов флуоресцентного мечения.

Ферментативная маркировка [ править ]

При ферментативной маркировке сначала формируется конструкция ДНК с использованием гена и ДНК флуоресцентного белка. [21] После транскрипции образуется гибрид РНК + флуоресцентный. Интересующий объект прикреплен к ферменту, который может распознавать эту гибридную ДНК. Обычно в качестве флуорофора используется флуоресцеин или биотин.

Маркировка химикатов [ править ]

Химическая маркировка или использование химических меток использует взаимодействие между небольшой молекулой и определенной генетической аминокислотной последовательностью. [22] Химическая маркировка иногда используется как альтернатива GFP. Синтетические белки, которые функционируют как флуоресцентные зонды, меньше, чем у GFP, и поэтому могут функционировать как зонды в более разнообразных ситуациях. Кроме того, они предлагают более широкий диапазон цветов и фотохимических свойств. [23] В связи с недавними достижениями в области химической маркировки химические метки предпочтительнее флуоресцентных белков из-за архитектурных и размерных ограничений характерного β-цилиндра флуоресцентного белка. Изменения флуоресцентных белков могут привести к потере флуоресцентных свойств. [22]

Маркировка белков [ править ]

При маркировке белков используется короткий тег, чтобы свести к минимуму нарушение сворачивания и функции белка. Переходные металлы используются для связывания определенных остатков в метках с сайт-специфическими мишенями, такими как N-концы, C-концы или внутренние сайты внутри белка. Примеры тегов, используемых для маркировки белков, включают теги биомышьяка, теги гистидина и теги FLAG. [1]

Генетическая маркировка [ править ]

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является примером метода генетической маркировки, в котором используются зонды, специфичные для участков хромосомы по длине хромосомы, также известной как окраска хромосом . Множественные флуоресцентные красители, каждый из которых имеет различную длину волны возбуждения и излучения, связываются с зондом, который затем гибридизуется с хромосомами. Флуоресцентный микроскоп может обнаруживать присутствующие красители и отправлять их на компьютер, который может выявить кариотип клетки. Этот метод позволяет выявить такие аномалии, как делеции и дупликации. [24]

Визуализация клеток [ править ]

Химические метки больше подходят для технологий визуализации, чем флуоресцентные белки, поскольку химические метки могут локализовать фотосенсибилизаторы ближе к целевым белкам. [25] Затем белки могут быть помечены и обнаружены с помощью визуализации, такой как микроскопия сверхвысокого разрешения , Ca 2+ -изображение , определение pH, обнаружение перекиси водорода, хромофорная световая инактивация и многофотонная световая микроскопия. Исследования изображений in vivo на живых животных были выполнены впервые с использованием мономерного белка, полученного из бактериальной галогеналкандегалогеназы, известного как Halo-tag. [22] [26] Гало-тег ковалентносвязывается со своим лигандом и позволяет лучше экспрессировать растворимые белки. [26]

Преимущества [ править ]

Хотя флуоресцентные красители могут не иметь такой же чувствительности, как радиоактивные зонды, они способны в реальном времени показывать активность молекул в действии. [27] Более того, радиация и надлежащее обращение больше не являются проблемой.

С развитием флуоресцентного мечения флуоресцентная микроскопия позволила визуализировать определенные белки как на фиксированных, так и на живых изображениях клеток. Локализация определенных белков привела к появлению важных концепций в клеточной биологии, таких как функции отдельных групп белков в клеточных мембранах и органеллах. При визуализации живых клеток флуоресцентные метки позволяют отслеживать перемещения белков и их взаимодействия. [24]

Последние достижения в методах использования флуоресцентных меток привели к визуализации мРНК и ее локализации в различных организмах. Визуализация РНК в живых клетках может быть достигнута путем введения синтезированной РНК, которая химически связана с флуоресцентной меткой, в живые клетки с помощью микроинъекции. Этот метод был использован, чтобы показать, как мРНК oskar в эмбрионе Drosophila локализуется в задней части ооцита . [28]

См. Также [ править ]

  • Велосиметрия с молекулярным мечением
  • Спектрофотометр для измерения нуклеиновых кислот
  • Белковые метки

Примечания [ править ]

  1. ^ a b c d e f Саху, Харекрушна (1 января 2012 г.). «Методы флуоресцентного мечения в биомолекулах: воспоминание». RSC Advances . 2 (18): 7017–7029. DOI : 10.1039 / C2RA20389H .
  2. ^ «Флуоресцентная маркировка биомолекул с помощью органических зондов - Презентации - PharmaXChange.info» . 29 января 2011 г.
  3. ^ Гвинн и Пейдж, Питер и Гай. «Тенденции лабораторных технологий: флуоресценция + маркировка» . Наука . Проверено 10 марта 2013 года .
  4. ^ a b Kricka LJ, Fortina P (апрель 2009 г.). «Аналитическое происхождение:« первые »в флуоресцентной маркировке нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот» . Клиническая химия . 55 (4): 670–83. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.116152 . PMID 19233914 . 
  5. ^ a b Jing C, Корнуолл VW (сентябрь 2011 г.). «Химические метки для маркировки белков внутри живых клеток» . Счета химических исследований . 44 (9): 784–92. DOI : 10.1021 / ar200099f . PMC 3232020 . PMID 21879706 .  
  6. ^ "Зеленый флуоресцентный белок - История GFP - Осаму Шимомура" .
  7. ^ Шимомура Осаму. «Нобелевская премия по химии» . Проверено 5 апреля 2013 года .
  8. ↑ Chen X, Smith LM, Bradbury EM (март 2000). «Сайт-специфическая массовая маркировка стабильными изотопами в белках для точной и эффективной идентификации белков». Аналитическая химия . 72 (6): 1134–43. DOI : 10.1021 / ac9911600 . PMID 10740850 . 
  9. ^ a b «Колориметрические анализы» . Проверено 3 апреля 2013 года .
  10. ^ Халеви, Revital; София Колушеваль; Роберт Э. У. Хэнкок; Раз Елинек (2002). «Колориметрические биосенсорные везикулы для биотехнологических применений» (PDF) . Материалы симпозиума Общества исследования материалов . 724. Биологические и биомиметические материалы - от свойств к функциям . Проверено 4 апреля 2013 года .
  11. ^ a b Lummer M, Humpert F, Wiedenlübbert M, Sauer M, Schüttpelz M, Staiger D (сентябрь 2013 г.). «Новый набор обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков для использования в трансгенных растениях» . Молекулярный завод . 6 (5): 1518–30. DOI : 10.1093 / MP / sst040 . PMID 23434876 . 
  12. ^ Perrier A, Maurel F, Jacquemin D (август 2012). «Мультифотохромизм одиночных молекул с диарилэтенами». Счета химических исследований . 45 (8): 1173–82. DOI : 10.1021 / ar200214k . PMID 22668009 . 
  13. ↑ Zhang Y, Yang J (январь 2013 г.). «Стратегии проектирования флуоресцентных биоразлагаемых полимерных биоматериалов» . Журнал Materials Chemistry B . 1 (2): 132–148. DOI : 10.1039 / C2TB00071G . PMC 3660738 . PMID 23710326 .  
  14. ^ "bioee.ee.columbia.edu" (PDF) . Архивировано из оригинального (PDF) 20 декабря 2012 года.
  15. ^ Кокс, Майкл; Нельсон, Дэвид Р .; Ленингер, Альберт Л (2008). Принципы биохимии Ленингера . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-7108-1.
  16. ↑ Jung D, Min K, Jung J, Jang W, Kwon Y (май 2013). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Молекулярные биосистемы . 9 (5): 862–72. DOI : 10.1039 / c2mb25422k . PMID 23318293 . 
  17. ^ Weil TT, Партон RM, Davis I (июль 2010). «Сделать сообщение ясным: визуализация локализации мРНК» . Тенденции в клеточной биологии . 20 (7): 380–90. DOI : 10.1016 / j.tcb.2010.03.006 . PMC 2902723 . PMID 20444605 .  
  18. ↑ Szent-Gyorgyi C, Schmidt BF, Schmidt BA, Creeger Y, Fisher GW, Zakel KL, Adler S, Fitzpatrick JA, Woolford CA, Yan Q, Vasilev KV, Berget PB, Bruchez MP, Jarvik JW, Wagoner A (февраль 2008 г. ). «Флуороген-активирующие одноцепочечные антитела для визуализации белков клеточной поверхности». Природная биотехнология (Аннотация). 26 (2): 235–40. DOI : 10.1038 / nbt1368 . PMID 18157118 . Мы сообщаем здесь о разработке белков-репортеров, которые генерируют флуоресценцию из темных молекул (флуорогенов). 
  19. ^ Plamont MA, Billon-Denis E, Maurin S, Gauron C, Pimenta FM, Specht CG, Shi J, Quérard J, Pan B, Rossignol J, Moncoq K, Morellet N, Volovitch M, Lescop E, Chen Y, Triller A , Вриз С., Ле Со Т., Жюльен Л., Готье А. (январь 2016 г.). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющую абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (3): 497–502. Bibcode : 2016PNAS..113..497P . DOI : 10.1073 / pnas.1513094113 . PMC 4725535 . PMID 26711992 .  
  20. ^ Paige JS, Ву KY, Jaffrey SR (июль 2011). «РНК-имитаторы зеленого флуоресцентного белка» . Наука . 333 (6042): 642–6. Bibcode : 2011Sci ... 333..642P . DOI : 10.1126 / science.1207339 . PMC 3314379 . PMID 21798953 .  
  21. ^ Рихтер A, Швагер C, Hentze S, Ансорге W, Hentze MW, Muckenthaler M (сентябрь 2002 г.). «Сравнение методов маркировки ДНК флуоресцентными метками, используемых для анализа экспрессии с помощью ДНК-микрочипов» (PDF) . Биотехнологии . 33 (3): 620-8, 630. DOI : 10,2144 / 02333rr05 . PMID 12238772 .  
  22. ^ a b c Wombacher R, Корнуолл VW (июнь 2011 г.). «Химические метки: применение в визуализации флуоресценции живых клеток» . Журнал биофотоники . 4 (6): 391–402. DOI : 10.1002 / jbio.201100018 . PMID 21567974 . 
  23. ↑ Jung D, Min K, Jung J, Jang W, Kwon Y (май 2013). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Молекулярные биосистемы . 9 (5): 862–72. DOI : 10.1039 / C2MB25422K . PMID 23318293 . 
  24. ^ a b Мэтью П. Скотт; Лодиш, Харви Ф .; Арнольд Берк; Кайзер, Крис; Монти Кригер; Энтони Бретчер; Хидде Плоег; Анжелика Амон (2012). Молекулярная клеточная биология . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-1-4292-3413-9.
  25. Перейти ↑ Ettinger, A (2014). «Флуоресцентная визуализация живых клеток» . Методы клеточной биологии . 123 : 77–94. DOI : 10.1016 / B978-0-12-420138-5.00005-7 . ISBN 9780124201385. PMC  4198327 . PMID  24974023 .
  26. ^ а б Н. Петерсон С., Квон К. (2012). «HaloTag: Улучшение экспрессии растворимых веществ и применение в функциональном анализе белков» . Современная химическая геномика . 6 (1): 8–17. DOI : 10.2174 / 1875397301206010008 . PMC 3480702 . PMID 23115610 .  
  27. ^ Праудников Д., Мирзабеков А. (ноябрь 1996 г.). «Химические методы флуоресцентного мечения ДНК и РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 24 (22): 4535–42. DOI : 10.1093 / NAR / 24.22.4535 . PMC 146275 . PMID 8948646 .  
  28. ^ Weil TT, Партон RM, Davis I (июль 2010). «Сделать сообщение ясным: визуализация локализации мРНК» . Тенденции в клеточной биологии . 20 (7): 380–90. DOI : 10.1016 / j.tcb.2010.03.006 . PMC 2902723 . PMID 20444605 .  

Внешние ссылки [ править ]

Библиотечные ресурсы по
флуоресцентной спектроскопии
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках