Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Оптическое картирование [1] - это метод построения упорядоченных рестрикционных карт с высоким разрешением на весь геном из отдельных окрашенных молекул ДНК, называемых «оптическими картами». Путем картирования местоположения сайтов рестрикционных ферментов вдоль неизвестной ДНК организма спектр образующихся фрагментов ДНК в совокупности служит уникальным «отпечатком пальца» или «штрих-кодом» для этой последовательности. Первоначально разработанный доктором Дэвидом С. Шварцем и его лабораторией в Нью-Йоркском университете в 1990-х годах [2], этот метод с тех пор стал неотъемлемой частью процесса сборки многих крупномасштабных проектов секвенирования как микробных, так и эукариотических геномов. Более поздние технологии используют плавление ДНК [3], конкурентное связывание ДНК [4] или ферментативную маркировку [5][6] для создания оптических отображений.

Технология [ править ]

Рабочий процесс оптического картирования
Рабочий процесс оптического картирования

Современная платформа оптического картографирования работает следующим образом: [7]

  1. Геномную ДНК получают из лизированных клеток и случайным образом разрезают для получения «библиотеки» больших геномных молекул для оптического картирования.
  2. Отдельная молекула ДНК растягивается (или удлиняется) и удерживается на предметном стекле под флуоресцентным микроскопом за счет взаимодействия зарядов.
  3. Молекула ДНК переваривается добавленными рестрикционными ферментами, которые расщепляются на определенных участках переваривания. Образовавшиеся фрагменты молекул остаются прикрепленными к поверхности. Концы фрагментов в сайтах расщепления оттянуты назад (из-за эластичности линеаризованной ДНК), оставляя зазоры, которые можно идентифицировать под микроскопом.
  4. Фрагменты ДНК, окрашенные интеркалирующим красителем, визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии и измеряются путем измерения интегральной интенсивности флуоресценции. Это создает оптическую карту отдельных молекул.
  5. Индивидуальные оптические карты объединяются для получения согласованной геномной оптической карты.

История платформы оптического картографирования [ править ]

Ранняя система [ править ]

Молекулы ДНК фиксировали на расплавленной агарозе, образовавшейся между покровным стеклом и предметным стеклом микроскопа. Фермент рестрикции предварительно смешивали с расплавленной агарозой перед размещением ДНК, и расщепление запускалось добавлением магния.

Использование заряженных поверхностей [ править ]

Вместо того, чтобы быть иммобилизованными в гелевой матрице, молекулы ДНК удерживались на месте за счет электростатических взаимодействий на положительно заряженной поверхности. Разрешение улучшилось, поэтому фрагменты размером от ~ 30 kb до 800 bp могли иметь размер.

Автоматизированная система [ править ]

Это включало разработку и интеграцию автоматизированной системы определения для определения нескольких отдельных молекул на слайде (например, микрочипа) для параллельной ферментативной обработки, автоматизированной флуоресцентной микроскопии для получения изображений, обработки изображений для обработки изображений, алгоритмов для построения оптических карт, кластера вычисления для обработки больших объемов данных

Высокопроизводительная система с использованием микрофлюидики [ править ]

Заметив, что микроматрицы с пятнами одиночных молекул не подходят для больших молекул геномной ДНК, были разработаны микрофлюидные устройства, использующие мягкую литографию, обладающую рядом параллельных микроканалов.

Система нового поколения с использованием технологии нанокодирования [ править ]

Усовершенствование оптического картирования, называемое «нанокодированием» [8] , может повысить производительность за счет захвата удлиненных молекул ДНК в наноконфайнментах.

Сравнения [ править ]

Другие методы картирования [ править ]

Преимущество ОМ перед традиционными методами картирования заключается в том, что он сохраняет порядок фрагментов ДНК, тогда как порядок необходимо восстанавливать с помощью рестрикционного картирования . Кроме того, поскольку карты строятся непосредственно из молекул геномной ДНК, исключаются артефакты клонирования или ПЦР. Однако на каждый процесс ОМ по-прежнему влияют ложноположительные и отрицательные сайты, поскольку не все сайты рестрикции расщепляются в каждой молекуле, а некоторые сайты могут быть разрезаны неправильно. На практике несколько оптических карт создаются из молекул одной и той же области генома, и для определения наилучшей консенсусной карты используется алгоритм. [9]

Другие методы анализа генома [ править ]

Существует множество подходов к выявлению крупномасштабных геномных вариаций (таких как инделки, дупликации, инверсии, транслокации) между геномами. Другие категории методов включают использование микроматриц , гель-электрофореза в импульсном поле , цитогенетику и парные концевые метки .

Использует [ редактировать ]

Первоначально система оптического картирования использовалась для построения полногеномных рестрикционных карт бактерий, паразитов и грибов. [10] [11] [12] Он также использовался для формирования и проверки бактериальных геномов. [13] Чтобы служить каркасом для сборки, собранные контиги последовательностей можно сканировать на предмет сайтов рестрикции in silico, используя известные данные о последовательностях и выравнивая их с собранной геномной оптической картой. Коммерческая компания Opgen предоставила оптические карты микробных геномов. Для более крупных геномов эукариот только лаборатория Дэвида С. Шварца (сейчас в Мэдисоне-Висконсине) создала оптические карты для мышей, [14] человека [15], риса [16] и кукурузы. [17]

Оптическое секвенирование [ править ]

Оптическое секвенирование - это метод секвенирования одной молекулы ДНК, который следует за синтезом и использует технологию оптического картирования. [18] [19] Подобно другим подходам к молекулярному секвенированию, таким как SMRT-секвенирование , этот метод анализирует одну молекулу ДНК, а не амплифицирует исходный образец и секвенирует несколько копий ДНК. Во время синтеза нуклеотиды, меченные флуорохромом, включаются с помощью ДНК-полимераз и отслеживаются с помощью флуоресцентной микроскопии . Этот метод был первоначально предложен Дэвидом С. Шварцем и Арвиндом Раманатаном в 2003 году.

Цикл оптического секвенирования [ править ]

Ниже приводится обзор каждого цикла процесса оптического секвенирования. [20]

Цикл оптического секвенирования

Этап 1. Штрих-кодирование ДНК.
Клетки лизируют для высвобождения геномной ДНК. Эти молекулы ДНК распутываются, помещаются на поверхность для оптического картирования, содержащую микрофлюидные каналы, и ДНК пропускается через каналы. Затем эти молекулы кодируются рестрикционными ферментами, чтобы обеспечить локализацию генома с помощью метода оптического картирования. См. Эти шаги в разделе «Технология» выше .

Шаг 2: Разбиение шаблона. Добавляется
ДНКаза I, которая случайным образом разрывает установленные молекулы ДНК. Затем выполняется промывка для удаления ДНКазы I. Среднее количество трещин, возникающих на одной матрице, зависит от концентрации ДНКазы I, а также от времени инкубации.

Шаг 3: Образование зазора
Добавляется экзонуклеаза Т7, которая использует зазоры в молекулах ДНК для расширения зазоров в направлении 5'– 3 '. Количество экзонуклеазы Т7 необходимо тщательно контролировать, чтобы избежать чрезмерно высоких уровней двухцепочечных разрывов.

Этап 4.
Включение флуорохромов. ДНК-полимераза используется для включения нуклеотидов, меченных флуорохромом (FdNTP), во множественные участки с разрывом вдоль каждой молекулы ДНК. Во время каждого цикла реакционная смесь содержит один тип FdNTP и допускает множественные добавления этого типа нуклеотидов. Затем выполняются различные промывки для удаления невключенных fdNTP для подготовки к визуализации и следующему циклу добавления FdNTP.

Этап 5. Визуализация. На
этом этапе подсчитывается количество включенных нуклеотидов, меченных флуорохромом, в области промежутка с помощью флуоресцентной микроскопии.

Шаг 6. Фотообесцвечивание
. Лазерное освещение, которое используется для возбуждения флуорохрома, также используется здесь для уничтожения сигнала флуорохрома. Это по существу сбрасывает счетчик флуорохромов и подготавливает счетчик к следующему циклу. Этот этап является уникальным аспектом оптического секвенирования, поскольку он фактически не удаляет флуорохромную метку нуклеотида после его включения. Отсутствие удаления флуорохромной метки делает секвенирование более экономичным, но приводит к необходимости последовательного включения флуорохромных меток, что может привести к проблемам из-за громоздкости этикеток.

Шаг 7. Повторите шаги 4–6.
Шаги 4–6 повторяются с шагом 4 с использованием реакционной смеси, которая каждый раз содержит другой меченый флуорохромом нуклеотид (FdNTP). Это повторяется до тех пор, пока желаемая область не будет секвенирована.

Стратегии оптимизации [ править ]

Выбор подходящей ДНК-полимеразы имеет решающее значение для эффективности этапа добавления основания и должен соответствовать нескольким критериям:

  • Способность эффективно включать FdNTP в последовательные позиции
  • Отсутствие 3'– 5 'экзонуклеазы и активности корректора для предотвращения удаления вновь включенных FdNTP
  • Высокая точность для минимизации ошибочного включения
  • Хорошая работа с шаблонами, которые прикреплены к поверхности (например, поверхность для оптического картирования)

Кроме того, различное предпочтение полимеразы для разных флуорохромов, длина линкера на флуорохром-нуклеотидах и состав буфера также являются важными факторами, которые следует учитывать для оптимизации процесса добавления оснований и максимального увеличения числа последовательных включений FdNTP.

Преимущества [ править ]

Одномолекулярный анализ
Поскольку требуется минимальный образец ДНК, можно избежать трудоемкого и дорогостоящего этапа амплификации, чтобы упростить процесс подготовки образца.

Матрицы больших молекул ДНК (~ 500 т.п.н.) по сравнению с шаблонами коротких молекул ДНК (<1 КБ) В то время как большинство технологий секвенирования следующего поколения нацелены на огромное количество считываний небольших последовательностей, эти считывания небольших последовательностей затрудняют попытки секвенирования de novo и затрудняют понимание повторяющихся участков генома . В оптическом секвенировании для секвенирования используются большие шаблоны молекул ДНК (~ 500 т.п.н.), что дает несколько преимуществ по сравнению с небольшими шаблонами:

  1. Эти большие ДНК-шаблоны могут быть «закодированы в ДНК», чтобы с уверенностью определять их геномную локализацию. Следовательно, любые считывания последовательности, взятые из большого шаблона, можно с высокой степенью достоверности сопоставить с геномом. Что еще более важно, считывания последовательности из областей с высоким числом повторов могут быть размещены с большей степенью уверенности, тогда как короткие чтения страдают от неопределенности картирования в областях с высоким числом повторов. Специальные алгоритмы и программное обеспечение, такие как оптическое картирование и нанокодирование, были разработаны для совмещения штрих-кодов одиночных молекул с эталонным геномом.
  2. Несколько последовательностей считываются из одной и той же большой молекулы-шаблона. Эти множественные считывания последовательностей уменьшают сложность сборки de novo, устраняют неоднозначность областей геномной перестройки и «по сути свободны от любых ошибок сборки». [20]
  3. Молекулярное штрих-кодирование больших молекулярных матриц ДНК с получением последовательностей обеспечивает широкий и специфический геномный анализ

Недостатки [ править ]

  • Секвенирование одиночной молекулы ДНК требует высокого уровня точности, чтобы соответствовать уверенности за счет избыточного покрытия считывания, обеспечиваемого современными технологиями секвенирования следующего поколения.
  • Зарубки на обеих цепях в аналогичных положениях, приводящие к низкому уровню матрицы во время синтеза.
  • Нуклеотиды, меченные флуорохромом, не удаляются после включения, и из-за этих объемных меток множественное включение может быть затруднено.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Чжоу, Шигуо; Джилл Хершелеб; Дэвид С. Шварц (2007). Единая молекулярная система для анализа всего генома . Новые высокопроизводительные технологии для секвенирования ДНК и геномики. 2 . Эльзевир . С. 269–304.
  2. ^ Шварц, округ Колумбия, и др. «Упорядоченные рестрикционные карты хромосом Saccharomyces Cerevisiae, построенные с помощью оптического картирования». Science 262.5130 (1993): 110–4.
  3. ^ Рейснер, Уолтер; Ларсен, Нильс Б .; Силахтароглу, Асли; Кристенсен, Андерс; Томмеруп, Нильс; Тегенфельдт, Йонас О .; Фливбьерг, Хенрик (27 июля 2010 г.). «Картирование денатурации одной молекулы ДНК в наножидкостных каналах» . Труды Национальной академии наук . 107 (30): 13294–13299. DOI : 10.1073 / pnas.1007081107 . ISSN 0027-8424 . PMC 2922186 . PMID 20616076 .   
  4. ^ Нильссон, Адам Н .; Эмильссон, Густав; Ниберг, Лена К .; Благородный, Чарльстон; Стадлер, Лизелотт Свенссон; Фриче, Иоахим; Мур, Эдвард РБ; Тегенфельдт, Йонас О .; Амбьёрнссон, Тобиас (02.09.2014). «Оптическое картирование ДНК на основе конкурентного связывания для быстрой идентификации бактерий - теория матрицы переноса нескольких лигандов и экспериментальные приложения на Escherichia coli» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (15): e118. DOI : 10.1093 / NAR / gku556 . ISSN 0305-1048 . PMC 4150756 . PMID 25013180 .   
  5. ^ Грюнвальд, Ассаф; Дахан, Моран; Гисберц, Анна; Нильссон, Адам; Ниберг, Лена К .; Вайнхольд, Эльмар; Амбьёрнссон, Тобиас; Вестерлунд, Фредрик; Эбенштейн, Юваль (2015-10-15). «Типирование штаммов бактериофагов методом экспресс-анализа одиночных молекул» . Исследования нуклеиновых кислот . 43 (18): e117. DOI : 10.1093 / NAR / gkv563 . ISSN 0305-1048 . PMC 4605287 . PMID 26019180 .   
  6. ^ Вранкен, Шарлотта; Дин, Йохем; Дирикс, Лив; Стакенборг, Тим; Дехаен, Вим; Лин, Фолькер; Хофкенс, Йохан; Нили, Роберт К. (2014-04-01). «Оптическое картирование ДНК сверхвысокого разрешения с помощью химии щелчков ДНК-метилтрансферазы» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (7): e50. DOI : 10.1093 / NAR / gkt1406 . ISSN 0305-1048 . PMC 3985630 . PMID 24452797 .   
  7. ^ Dimalanta, ET et al. Микрожидкостная система для больших массивов молекул ДНК. Анальный. Chem. 76 (2004): 5293–5301.
  8. ^ Джо, К. и др. «Система штрих-кодирования одной молекулы с использованием нанощелей для анализа ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 104.8 (2007): 2673–8.
  9. ^ Valouev, А., Шварц Д., Чжоу, S., и Waterman, МС «Алгоритм сборки упорядоченных отображения ограничения из единичных молекул ДНК.» RECOMB '98: Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 103 (2006): 15770–15775.
  10. ^ Лай, З., и др. «Оптическая карта дробовика всего генома Plasmodium Falciparum». Генетика природы 23.3 (1999): 309–13.
  11. ^ Лим А. и др. «Оптические карты дробовика всего генома Escherichia Coli O157: H7». Исследование генома 11.9 (2001): 1584-93.
  12. ^ Lin, J., et al. «Полногеномное оптическое картирование Deinococcus Radiodurans». Science 285.5433 (1999): 1558–62.
  13. ^ Nagarajan, N., et al. «Строительные леса и проверка сборок бактериального генома с использованием оптических ограничительных карт». Биоинформатика 24.10 (2008): 1229–35.
  14. ^ Черч, Д.М. и др. Специфическая биология клонов выявлена ​​с помощью законченной сборки генома мыши. PLoS Biology, 7.5 (2009): e1000112.
  15. ^ Кидд, JM et al. Картирование и секвенирование структурных вариаций восьми геномов человека. Nature 453 (2008): 56–64.
  16. ^ Чжоу, С. и др. Проверка последовательности генома риса с помощью оптического картирования. BMC Genomics 8 (2007): 278.
  17. ^ Чжоу, С. и др. Одномолекулярный каркас для генома кукурузы. PLoS Genetics, 5.11 (2009): epub.
  18. ^ Раманатан, А., и др. «Интегративный подход к оптическому секвенированию отдельных молекул ДНК». Аналитическая биохимия 330.2 (2004): 227–41.
  19. ^ Раманатан, А., Пейпер, Л., и Шварц, округ Колумбия «Включение нуклеотидов, меченных флуорохромом, с помощью полимеразы высокой плотности». Аналитическая биохимия 337.1 (2005): 1–11.
  20. ^ a b Чжоу, С., Пейпер, Л., и Шварц, Д.К. «Оптическое секвенирование: сбор данных из нанесенных на карту шаблонов одиночных молекул». Секвенирование генома следующего поколения: к персонализированной медицине. Эд. Михал Яниц. 1-е изд. Вайли-ВЧ, 2008. 133–151.

Внешние ссылки [ править ]

  • Решения OpGen для оптического картирования
  • Лаборатория доктора Дэвида С. Шварца