Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Теги с парными концами (ПЭТ) (иногда «диТэги с парными концами» или просто «дитаги») представляют собой короткие последовательности на 5 'и 3' концах фрагмента ДНК, которые достаточно уникальны, чтобы (теоретически) существовать только вместе. один раз в геноме , что делает последовательность ДНК между ними доступной при поиске (если доступны данные о последовательности полного генома) или при дальнейшем секвенировании (поскольку сайты меток достаточно уникальны, чтобы служить в качестве сайтов отжига праймеров ). Теги с парными концами (ПЭТ) существуют в библиотеках ПЭТ с отсутствующей промежуточной ДНК, то есть ПЭТ «представляет» более крупный фрагмент генома или кДНК.состоящий из короткой 5'-линкерной последовательности, короткой 5'-последовательности, короткой 3'-последовательности и короткой 3'-линкерной последовательности. Концептуально было показано, что 13 пар оснований достаточно для однозначного сопоставления тегов. [1] Однако более длинные последовательности более практичны для однозначного сопоставления считываний. В эндонуклеазах (обсуждаются ниже) , используемые для получения более длинные ПЭПА дают меткам (18/20 пар оснований и 25/27 пары оснований) , но последовательности 50-100 пара оснований было бы оптимальной как для отображения и эффективности затрат. [1] После извлечения ПЭТ из многих фрагментов ДНК они связываются (конкатенируются) вместе для эффективного секвенирования. В среднем 20–30 тегов можно секвенировать с помощью метода Сэнгера , который имеет большую длину чтения. [1]Поскольку последовательности тегов короткие, отдельные ПЭТ хорошо подходят для секвенирования следующего поколения, которое имеет короткие длины считывания и более высокую пропускную способность. Основными преимуществами секвенирования ПЭТ являются его меньшая стоимость за счет секвенирования только коротких фрагментов, обнаружение структурных вариантов в геноме и повышенная специфичность при обратном выравнивании по геному по сравнению с одиночными метками, которые включают только один конец фрагмента ДНК.

Создание библиотеки ПЭТ [ править ]

Рабочий процесс построения библиотеки PET на основе клонирования и без клонирования.

Библиотеки ПЭТ обычно получают двумя общими методами: на основе клонирования и на основе без клонирования.

На основе клонирования [ править ]

Представляющие интерес фрагментированные геномные ДНК или комплементарные ДНК (кДНК) клонируют в плазмидные векторы . Сайты клонирования фланкированы адапторными последовательностями, которые содержат сайты рестрикции для эндонуклеаз (обсуждаются ниже). Вставки лигируют с плазмидными векторами, а затем индивидуальные векторы трансформируют в E.coli, получая библиотеку ПЭТ. Последовательности ПЭТ получают путем очистки плазмиды и переваривания специфической эндонуклеазой, оставляя две короткие последовательности на концах векторов. В внутримолекулярных (разбавленных) условиях векторы повторно циркулируют и лигируют, оставляя только дитаги в векторе. Последовательности, уникальные для клона, теперь объединены в пары. В зависимости от секвенирования следующего поколенияПо методике ПЭТ-последовательности можно оставить сингулярными, димеризованными или объединенными в длинные цепочки. [1]

Без клонирования [ править ]

Вместо клонирования адаптеры, содержащие последовательность эндонуклеазы, лигируют с концами фрагментированной геномной ДНК или кДНК. Затем молекулы самоакультируются и расщепляются эндонуклеазой, высвобождая ПЭТ. [1] Перед секвенированием эти ПЭТ лигируют с адаптерами, к которым отжигаются праймеры ПЦР для амплификации. Преимущество построения библиотеки на основе клонирования состоит в том, что она сохраняет фрагменты или кДНК нетронутыми для будущего использования. Однако процесс строительства намного дольше, чем метод без клонирования. Компании, занимающиеся секвенированием следующего поколения, разработали варианты построения библиотек в соответствии с их соответствующими технологиями. [1]

Эндонуклеазы [ править ]

В отличие от других эндонуклеаз, то MmeI (тип IIS) и EcoP15I (тип III) эндонуклеазы рестрикции отрезать вниз по течению от их целевого сайты связывания. MmeI разрезает 18/20 пар оснований ниже [2], а EcoP15I разрезает 25/27 пар оснований ниже по течению. [3] Поскольку эти рестрикционные ферменты связываются со своими целевыми последовательностями, расположенными в адаптерах, они разрезают и высвобождают векторы, которые содержат короткие последовательности фрагмента или кДНК, сшитые с ними, с образованием ПЭТ.

Приложения для ПЭТ [ править ]

Пример ПЭТ-обнаружения делеций и вставок.
Пример альтернативных структур транскриптов, обнаруженных с помощью РНК-ПЭТ.
  1. ДНК-ПЭТ : поскольку ПЭТ представляет собой связь между тегами, использование ПЭТ при повторном секвенировании генома имеет преимущества по сравнению с использованием одиночных считываний . Это приложение называется парным конечным секвенированием , в просторечии известным как секвенирование двуствольного ружья . Однозначная привязка одной половины пары к одному месту в геноме позволяет картировать другую половину, что неоднозначно. Неоднозначные чтения - это те, которые относятся к более чем одному месту. Эта повышенная эффективность снижает стоимость секвенирования, поскольку эти неоднозначные последовательности или считывания обычно отбрасываются. Связность последовательностей ПЭТ также позволяет обнаруживать структурные вариации: вставки , делеции ,дупликации , инверсии , транслокации . [1] [4] Во время конструирования библиотеки PET можно выбрать фрагменты, чтобы все они имели определенный размер. Таким образом, ожидается, что после картирования последовательности ПЭТ будут постоянно находиться на определенном расстоянии друг от друга. Несоответствие этого расстояния указывает на структурную вариацию между последовательностями ПЭТ. Например (рисунок справа): делеция в секвенированном геноме будет считывать эту карту дальше, чем ожидалось в эталонном геноме, поскольку эталонный геном будет иметь сегмент ДНК, которого нет в секвенированном геноме.
  2. ChIP-PET : комбинированное использование иммунопреципитации хроматина ( ChIP ) и PET используется для обнаружения участков ДНК, связанных с интересующим белком. ChIP-PET имеет преимущество перед секвенированием однократного считывания за счет уменьшения неоднозначности генерируемых считываний. Преимущество перед гибридизацией чипа ( ChIP-Chip ) состоит в том, что мозаичные массивы гибридизации не обладают статистической чувствительностью, присущей считыванию последовательностей. Однако ChIP-PET, ChIP-Seq [5] [6] [7] и ChIP-chip [8] оказались весьма успешными. [1]
  3. ChIA-PET : применение секвенирования ПЭТ для анализа взаимодействия хроматина. Это общегеномная стратегия для обнаружения de novo дальнодействующих взаимодействий между элементами ДНК, связанными с белковыми факторами. [9] Первый ChIA-PET был разработан Fullwood et al. . (2009) [9] для создания карты взаимодействий между хроматином, связанным с рецептором эстрогена α (ER-α) в обработанных эстрогеномклетках аденокарциномы молочной железы человека. [9] ChIA-PET - это беспристрастный способ анализа взаимодействий и структур хроматина более высокого порядка, поскольку он может обнаруживать взаимодействия между неизвестными элементами ДНК. Напротив, 3C и 4Cметоды используются для обнаружения взаимодействий, затрагивающих конкретную целевую область в геноме. ChIA-PET похож на поиск генов слияния с помощью RNA-PET в том смысле, что парные метки отображаются в различных областях генома. [1] Однако ChIA-PET включает искусственное лигирование между различными фрагментами ДНК, расположенными в разных геномных областях, а не естественное слияние между двумя геномными областями, как в RNA-PET.
  4. РНК-ПЭТ : это приложение используется для изучения транскриптома : транскриптов, структур генов и экспрессии генов. [1] [10] Библиотека PET генерируется с использованием полноразмерных кДНК, поэтому метки представляют собой 5'-кэпированные и 3'-концевые сигнатуры полиА отдельных транскриптов. Следовательно, РНК-ПЭТ особенно полезен для разграничения границ единиц транскрипции. Это поможет определить альтернативные сайты начала транскрипции и сайты полиаденилирования генов. [1] РНК-ПЭТ также можно использовать для обнаружения генов слияния и транс-сплайсинга , но для их различения необходимы дальнейшие эксперименты. [11]Другие методы поиска границ транскриптов включают стратегии одиночного тега CAGE , SAGE и самый последний SuperSAGE , при этом CAGE и 5 'SAGE определяют сайты начала транскрипции, а 3' SAGE определяют сайты полиаденилирования . [1] Преимущества ПЭТ-секвенирования перед этими методами заключаются в том, что ПЭТ идентифицирует оба конца транскриптов и, в то же время, обеспечивает большую специфичность при картировании обратно в геном. Секвенирование кДНК может детально раскрыть структуру транскриптов, но этот подход намного дороже, чем секвенирование РНК-ПЭТ, особенно для характеристики всего транскриптома . [10]Основным ограничением РНК-ПЭТ является отсутствие информации об организации внутренних экзонов транскриптов. Следовательно, РНК-ПЭТ не подходит для обнаружения альтернативного сплайсинга . Кроме того, если используется процедура клонирования , сконструируйте библиотеку кДНК до создания ПЭТ, кДНК, которые трудно клонировать (в результате длинных транскриптов), будут иметь меньшее покрытие. [10] Точно так же транскрипты (или изоформы транскриптов) с низким уровнем экспрессии, вероятно, также будут недостаточно представлены.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d e f g h i j k l Фулвуд MJ, Wei CL, Liu ET, Ruan Y. 2009. ДНК-секвенирование нового поколения с парными концевыми метками (ПЭТ) для анализа транскриптома и генома. Геномные исследования. 19: 521–532. PMID  19339662
  2. ^ Морган РД, Бхатия Т.К., Ловаско Л, Дэвис ТБ. 2008. MmeI: минимальная система рестрикции-модификации типа II, которая модифицирует только одну цепь ДНК для защиты хозяина. Nucleic Acids Res. 36: 6558–6570.
  3. ^ Matsumura H, Reich S, Ito A, Saitoh H, Kamoun S, Winter P, Kahl G, Reuter M, Kruger DH, Terauchi R. 2003. Анализ экспрессии генов при взаимодействии растений-хозяев и патогенов с помощью SuperSAGE. Proc. Natl. Акад. Sci. 100: 15718–15723.
  4. ^ МакКернан и др. 2009. Последовательность и структурные вариации в геноме человека, обнаруженные короткочитаемым, массивно параллельным секвенированием лигирования с использованием двухосновного кодирования. Геномные исследования. 19: 1527-1541.
  5. ^ Барский А, Cuddapa S, Цуй К, Рох TY, Schönes ДЕ, Ван Z, G Вэй, Чепелев я, Чжао К. 2007. Высокое разрешение профилировании гистонов метилирования в геноме человека. Клетка. 129: 823–837.
  6. ^ Джонсон Д.С., Мортазави А., Майерс Р.М., Уолд Б. 2007. Полногеномное картирование взаимодействий белок-ДНК in vivo. Наука. 316: 1497–1502.
  7. ^ Chen X et al. 2008. Интеграция внешних сигнальных путей с основной транскрипционной сетью в эмбриональных стволовых клетках. Ячейка 133: 1106–1117.
  8. ^ Wu J, Smith LT, Plass C, Huang TH. 2006. Чип-чип достигает совершеннолетия для полногеномного функционального анализа. Cancer Res. 66 (14): 6899–902
  9. ^ a b c Фуллвуд MJ, Лю MH, Pan YF et al. 2009. Эстроген-рецептор-альфа-связанный хроматиновый интерактом человека. Природа. 462: 58-64.
  10. ^ a b c Ng P, Wei CL, Sung WK ​​et al. 2005. Анализ сигнатуры идентификации генов (GIS) для характеристики транскриптома и аннотации генома. Nat. Методы. 2: 105–111.
  11. ^ Ruan Y, Ooi HS, Choo SW et al. 2007. Слияние транскриптов и транскрибированных ретротранспозированных локусов обнаружено посредством всестороннего анализа транскриптомов с использованием парных концевых тегов (ПЭТ). Genome Res. 17: 828–838.