Количественный анализ без меток
Количественная оценка без меток — это метод масс-спектрометрии , целью которого является определение относительного количества белков в двух или более биологических образцах. В отличие от других методов количественного определения белка , количественный анализ без метки не использует соединение, содержащее стабильный изотоп , для химического связывания и, таким образом, маркировки белка. [1] [2]
Безметочная количественная оценка может быть основана на интенсивности исходного сигнала или на спектральном подсчете . Первый метод полезен при применении к высокоточным масс-спектрам, таким как те, которые получены с использованием нового поколения времяпролетных (ToF), ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье ( FTICR ) или масс-анализаторов Orbitrap. Мощность с высоким разрешением облегчает извлечение сигналов пептидов на уровне MS 1 и, таким образом, отделяет количественную оценку от процесса идентификации. Напротив, спектральный подсчет просто подсчитывает количество спектров, идентифицированных для данного пептида в различных биологических образцах, а затем объединяет результаты для всех измеренных пептидов белка (белков), которые количественно оцениваются.
Вычислительная структура подхода без меток включает в себя обнаружение пептидов, сопоставление соответствующих пептидов по нескольким данным ЖХ-МС, выбор дискриминационных пептидов. [3] [4]
Спектрометрия экспрессии интактного белка (IPEx) представляет собой метод количественного определения без использования меток в масс-спектрометрии, разрабатываемый группой аналитической химии в Центре безопасности пищевых продуктов и прикладного питания Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и в других местах. Интактные белки анализируют с помощью прибора LCMS , обычно квадрупольного времяпролетного в режиме профиля, а полный профиль белка определяют и количественно оценивают с помощью программного обеспечения для обработки данных.Первые результаты очень обнадеживают. В одном исследовании две группы повторов лечения из образцов млекопитающих (разные организмы с аналогичной историей лечения, но не технические повторы) показывают десятки биомаркеров белка с низким уровнем CV, что позволяет предположить, что IPEx является жизнеспособной технологией для изучения экспрессии белка. [5]
Как правило, сигналы пептидов обнаруживаются на уровне MS1 и отличаются от химических шумов характерной изотопной структурой. Эти закономерности затем отслеживаются по измерению времени удерживания и используются для реконструкции хроматографического профиля элюирования моноизотопной пептидной массы. Затем общий ионный ток пептидного сигнала интегрируют и используют в качестве количественного измерения исходной концентрации пептида. Для каждого обнаруженного пептида сначала находят все изотопные пики, а затем присваивают состояние заряда.
Количественное определение без метки может быть основано на интенсивности сигнала предшественника и имеет проблемы из-за помех изоляции: в высокопроизводительных исследованиях идентификация измеряемого иона-предшественника пептида может легко быть совершенно другим пептидом с аналогичным отношением m / z и который элюируется во временные рамки, перекрывающиеся с временными рамками первого пептида. Спектральный подсчет имеет проблемы из-за того, что пептиды идентифицируются, что делает необходимым проведение дополнительного сканирования МС/МС, которое требует времени и, следовательно, снижает разрешение эксперимента.
