Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
ядерное включение-эндопептидаза
TEV protease summary.png
Протеаза TEV (белый) в комплексе с пептидным субстратом (черный) с остатками триады активного центра (красный). ( PDB : 1 фунт )
Идентификаторы
ЕС нет.3.4.22.44
№ CAS139946-51-3
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
BRENDABRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
Структуры PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
Поиск
ЧВКстатьи
PubMedстатьи
NCBIбелки

Протеаза TEV ( EC 3.4.22.44 , эндопептидаза ядерного включения вируса гриппа табака ) представляет собой высокоспецифичную цистеиновую протеазу из вируса гриппа табака (TEV). [1] Это является членом рода PA из химотрипсин - подобных протеаз. [2] Из-за высокой специфичности последовательности он часто используется для контролируемого расщепления гибридных белков in vitro и in vivo . [3]

Происхождение [ править ]

Вирус табачного травления кодирует весь свой геном в виде одной массивного полипротеина (350 кДа). Он расщепляется на функциональные единицы тремя протеазами: протеазой P1 (1 сайт расщепления), протеазой вспомогательного компонента (1 сайт расщепления) и протеазой TEV (7 сайтов расщепления). [1] Нативная протеаза TEV также содержит внутренний сайт саморасщепления. Этот сайт медленно расщепляется, чтобы инактивировать фермент (физиологическая причина этого неизвестна).

Структура и функции [ править ]

Структура протеазы TEV. Двойные β-бочки, определяющие суперсемейство, выделены красным. ( PDB : 1лвм )

Структура протеазы TEV решена с помощью рентгеновской кристаллографии . [4] Он состоит из двух β-бочек и гибкого С-концевого хвоста и демонстрирует структурную гомологию с суперсемейством химотрипсинов протеаз ( клан PA , семейство C4 по классификации MEROPS ). [2] Несмотря на то, что она гомологична клеточным сериновым протеазам (таким как трипсин , эластаза , тромбин и т. Д.), Протеаза TEV использует цистеин в качестве своего каталитического нуклеофила [5] (как и многие другие вирусные протеазы).

Ковалентный катализ выполняется с помощью триады Asp-His-Cys , разделенной между двумя цилиндрами (Asp на β1 и His и Cys на β2). [6] Субстрат удерживается как β-лист, образуя антипараллельное взаимодействие с щелью между цилиндрами и параллельное взаимодействие с С-концевым хвостом. [7] Таким образом, фермент образует связывающий туннель вокруг субстрата, а взаимодействия с боковыми цепями контролируют специфичность. [4]

Специфика [ править ]

Поверхностная модель TEV, связанного с нерасщепленным субстратом (черный), также показывает каталитическую триаду (красный). Субстрат связывается внутри туннеля активного сайта (слева). В разрезе (справа) показана дополнительная форма связывающего туннеля к субстрату. ( PDB : 1 фунт )

Предпочтительная нативная последовательность расщепления была сначала идентифицирована путем исследования сайтов разрезания в природном полипротеиновом субстрате на повторяющуюся последовательность. Консенсусом для этих нативных сайтов разрезания является ENLYFQ \ S, где '\' обозначает расщепленную пептидную связь . [8] Остатки субстрата помечены от P6 до P1 перед участком разреза и P1 'после участка разреза. В ранних работах также измерялось расщепление массива подобных субстратов, чтобы охарактеризовать, насколько протеаза специфична для нативной последовательности. [9] [10]

Впоследствии в исследованиях использовалось секвенирование расщепленных субстратов из пула рандомизированных последовательностей для определения паттернов предпочтений. [11] [12] Хотя ENLYFQ \ S является оптимальной последовательностью, протеаза активна в большей или меньшей степени на ряде субстратов (т.е. демонстрирует некоторую неразборчивость субстратов ). Наибольшее расщепление происходит у последовательностей, наиболее близких к консенсусу EXLYΦQ \ φ, где X - любой остаток, Φ - любой большой или средний гидрофоб, а φ - любой небольшой гидрофобный или полярный остаток. Хотя эта последовательность является оптимальной, последовательности с нежелательными остатками в некоторых положениях все же могут быть отщеплены, если остальная часть последовательности оптимальна. [10] [12]

Специфичность обеспечивается большой площадью контакта между ферментом и субстратом. Протеазы, такие как трипсин, обладают специфичностью в отношении одного остатка до и после расщепленной связи из-за неглубокой связывающей щели только с одним или двумя карманами, которые связывают боковые цепи субстрата. Напротив, вирусные протеазы, такие как протеаза TEV, имеют длинный C-концевой хвост, который полностью покрывает субстрат, создавая туннель связывания. Этот туннель содержит набор плотно связывающихся карманов, так что каждая боковая цепь пептида-субстрата (от P6 до P1 ') связана в комплементарном сайте (от S6 до S1'). [4]

В частности, боковая цепь пептида P6-Glu контактирует с сетью из трех водородных связей; P5-Asn указывает на растворитель, не производя специфических взаимодействий (отсюда отсутствие консенсуса по субстрату в этом положении); P4-Leu находится в гидрофобном кармане; P3-Tyr удерживается в гидрофобном кармане с короткой водородной связью на конце; P2-Phe также окружен гидрофобами, включая лицевую сторону гистидина триады; P1-Gln образует четыре водородные связи; и P1'-Ser лишь частично заключен в неглубокую гидрофобную бороздку. [4]

Как биохимический инструмент [ править ]

Одно из основных применений этого белка - удаление аффинных меток из очищенных рекомбинантных слитых белков . Причиной использования протеазы TEV в качестве биохимического инструмента является ее высокая специфичность к последовательности. Эта специфичность позволяет контролировать расщепление белков, когда предпочтительную последовательность вставляют в гибкие петли. Это также делает его относительно нетоксичным in vivo, поскольку распознаваемая последовательность редко встречается в белках. [13]

Хотя рациональный дизайн имел ограниченный успех в изменении специфичности протеазы, направленная эволюция использовалась для изменения предпочтительного остатка либо до [14], либо после [15] [16] сайта расщепления.

Однако протеаза TEV как биохимический инструмент имеет ограничения. Он склонен к дезактивации за счет саморасщепления (автолиза), хотя это можно отменить с помощью единственной мутации S219V во внутреннем сайте расщепления. [17] Протеаза, экспрессируемая отдельно, также плохо растворима, однако было сделано несколько попыток улучшить ее растворимость путем направленной эволюции и компьютерного дизайна. Также было показано, что экспрессия может быть улучшена путем слияния с мальтозосвязывающим белком (MBP), который действует как партнер, повышающий растворимость.

Сообщалось, что протеаза TEV демонстрирует 10-кратную потерю активности при 4 ° C. [18] TEV протеаза теряет активность при температурах выше 34 ° C. [19]

Молекулярная масса этого фермента варьируется от 25 до 27 кДа в зависимости от конкретной используемой конструкции.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b UniProt: полипротеин TEV: "P04517" .
  2. ^ a b Роулингс Н.Д., Барретт А.Дж., Бейтман А. (январь 2012 г.). «МЕРОПС: база данных протеолитических ферментов, их субстратов и ингибиторов» . Nucleic Acids Res . 40 (Выпуск базы данных): D343–50. DOI : 10.1093 / NAR / gkr987 . PMC 3245014 . PMID 22086950 .  
  3. ^ Kapust RB, Вог DS (июль 2000). «Контролируемый внутриклеточный процессинг гибридных белков протеазой TEV». Protein Expr. Purif . 19 (2): 312–8. DOI : 10,1006 / prep.2000.1251 . PMID 10873547 . 
  4. ^ a b c d Phan J, Zdanov A, Evdokimov AG, Tropea JE, Peters HK, Kapust RB, Li M, Wlodawer A, Waugh DS (декабрь 2002 г.). «Структурные основы субстратной специфичности протеазы вируса травления табака» . J. Biol. Chem . 277 (52): 50564–72. DOI : 10.1074 / jbc.M207224200 . PMID 12377789 . 
  5. ^ Базан JF, Fletterick RJ (ноябрь 1988). «Вирусные цистеиновые протеазы гомологичны трипсиноподобному семейству сериновых протеаз: структурные и функциональные последствия» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 85 (21): 7872–6. Bibcode : 1988PNAS ... 85.7872B . DOI : 10.1073 / pnas.85.21.7872 . PMC 282299 . PMID 3186696 .  
  6. ^ Догерти РГ, парки ТД, Cary С.М., Базан JF, Fletterick RJ (сентябрь 1989). «Характеристика каталитических остатков протеиназы 49 кДа вируса травления табака». Вирусология . 172 (1): 302–10. DOI : 10.1016 / 0042-6822 (89) 90132-3 . PMID 2475971 . 
  7. ↑ Tyndall JD, Nall T, Fairlie DP (март 2005 г.). «Протеазы универсально распознают бета-цепи в своих активных сайтах». Chem. Ред . 105 (3): 973–99. DOI : 10.1021 / cr040669e . PMID 15755082 . 
  8. ^ Каррингтон JC, Догерти WG (май 1988). «Кассета сайта вирусного расщепления: идентификация аминокислотных последовательностей, необходимых для процессинга полипротеина вируса травления табака» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 85 (10): 3391–5. Bibcode : 1988PNAS ... 85.3391C . DOI : 10.1073 / pnas.85.10.3391 . PMC 280215 . PMID 3285343 .  
  9. ^ Догерти РГ, Cary С.М., парки TD (август 1989). «Молекулярно-генетический анализ сайта расщепления полипротеина вируса растений: модель». Вирусология . 171 (2): 356–64. DOI : 10.1016 / 0042-6822 (89) 90603-X . PMID 2669323 . 
  10. ^ a b Капуст, Рэйчел Б .; Тёзсер, Йожеф; Коупленд, Терри Д.; Во, Дэвид С. (28.06.2002). «Специфичность P1 'протеазы вируса травления табака». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях . 294 (5): 949–955. CiteSeerX 10.1.1.375.4271 . DOI : 10.1016 / S0006-291X (02) 00574-0 . ISSN 0006-291X . PMID 12074568 .   
  11. ^ Бульвара KT, Jabaiah A, Догерти PS (июнь 2010). «Эволюционная оптимизация пептидных субстратов для протеаз, демонстрирующих быструю кинетику гидролиза». Biotechnol. Bioeng . 106 (3): 339–46. DOI : 10.1002 / bit.22693 . PMID 20148412 . 
  12. ^ a b Kostallas G, Löfdahl PÅ, Samuelson P (2011). «Профилирование субстрата протеазы вируса травления табака с использованием нового флуоресцентного анализа целых клеток» . PLoS ONE . 6 (1): e16136. Bibcode : 2011PLoSO ... 616136K . DOI : 10.1371 / journal.pone.0016136 . PMC 3022733 . PMID 21267463 .  
  13. ^ Parks TD, Leuther KK, Говард Д., Джонстон С.А., Догерти WG (февраль 1994). «Высвобождение белков и пептидов из слитых белков с использованием протеиназы рекомбинантного вируса растений». Анальный. Биохим . 216 (2): 413–7. DOI : 10.1006 / abio.1994.1060 . PMID 8179197 . 
  14. ↑ Yi L, Gebhard MC, Li Q, Taft JM, Georgiou G, Iverson BL (апрель 2013 г.). «Разработка вариантов протеазы TEV с помощью дрожжевого скрининга секвестрации ER (YESS) комбинаторных библиотек» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 110 (18): 7229–34. Bibcode : 2013PNAS..110.7229Y . DOI : 10.1073 / pnas.1215994110 . PMC 3645551 . PMID 23589865 .  
  15. ^ Renicke C, Spadaccini R, Таксис C (2013). «Протеаза вируса травления табака с повышенной устойчивостью к субстрату в положении P1 '» . PLoS ONE . 8 (6): e67915. Bibcode : 2013PLoSO ... 867915R . DOI : 10.1371 / journal.pone.0067915 . PMC 3691164 . PMID 23826349 .  
  16. ↑ Verhoeven KD, Altstadt OC, Савинов С.Н. (март 2012 г.). «Внутриклеточное обнаружение и эволюция сайт-специфических протеаз с использованием системы генетической селекции». Прил. Биохим. Biotechnol . 166 (5): 1340–54. DOI : 10.1007 / s12010-011-9522-6 . PMID 22270548 . 
  17. ^ Kapust RB, Tőzsér J, Fox JD, Anderson DE, Cherry S, Copeland TD, Вог DS (декабрь 2001). «Протеаза вируса травления табака: механизм автолиза и рациональный дизайн стабильных мутантов с каталитическими способностями дикого типа» . Protein Eng . 14 (12): 993–1000. DOI : 10,1093 / белок / 14.12.993 . PMID 11809930 . 
  18. ^ РАРАН-Kurussi S, Tőzsér J, S Cherry, Tropea JE, Вог DS (15 мая 2013). «Дифференциальная температурная зависимость протеаз вируса травления табака и риновируса 3C» . Аналитическая биохимия . 436 (2): 142–144. DOI : 10.1016 / j.ab.2013.01.031 . PMC 4196241 . PMID 23395976 .  
  19. ^ Nallamsetty S, Kapust РБ, Tőzsér Дж, Вишневый S, Тропея JE, Copeland ТД, Вог DS (ноябрь 2004 г.). «Эффективная сайт-специфическая обработка слитых белков протеазой вируса пятнистости жилок табака in vivo и in vitro ». Protein Expr. Purif . 38 (1): 108–115. DOI : 10.1016 / j.pep.2004.08.016 . PMID 15477088 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Полипротеин TEV на UniProt
  • TEV протеаза на MEROPS
  • Национальный институт рака, TEV FAQ