Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Реконструкция предковой последовательности ( ASR ), также известная как реконструкция предкового гена / последовательности / воскрешение - это метод, используемый при изучении молекулярной эволюции . В этом методе используются родственные последовательности для реконструкции «предкового» гена из множественного выравнивания последовательностей . [1]

Этот метод можно использовать для «воскрешения» предковых белков и был предложен в 1963 году Линусом Полингом и Эмилем Цукеркандлом . [2] В случае ферментов этот подход получил название палеоэнзимологии (англ. Palaeoenzymology). Некоторые ранние попытки были предприняты в 1980-х и 1990-х годах под руководством лаборатории Стивена А. Беннера , чтобы продемонстрировать потенциал этой техники. [3] Благодаря усовершенствованию алгоритмов и более совершенным методам секвенирования и синтеза в начале 2000-х годов этот метод получил дальнейшее развитие, что позволило воскресить большее разнообразие и гораздо более древние гены. [4]За последнее десятилетие воскрешение предковых белков развилось как стратегия, позволяющая раскрыть механизмы и динамику эволюции белков. [5]

Принципы [ править ]

Иллюстрация филогенетического дерева и его роли в концептуализации проведения ASR.
Алгоритм восстановления наследственных последовательностей 1, 2 и 3 (см. Рисунок выше). Наследственная последовательность последовательности 1 может быть восстановлена ​​из B и C, если доступна хотя бы одна внешняя группа, например D или E. Например, последовательности B и C различаются в положении 4, но поскольку последовательности D и E имеют C в этом положении, последовательность 1, скорее всего, также имеет C. Последовательность 3 не может быть полностью реконструирована без дополнительной последовательности внешних групп (неопределенность обозначена знаком «X»).

В отличие от традиционных эволюционных и биохимических подходов к изучению белков, то есть так называемого горизонтального сравнения гомологов родственных белков с разных концов ветвей древа жизни ; ASR исследует статистически выведенные предковые белки в узлах дерева - вертикально (см. Диаграмму справа). Этот подход дает доступ к свойствам белка, которые могли временно возникать в течение эволюционного времени, и недавно был использован как способ сделать вывод о потенциальных давлениях отбора, которые привели к сегодняшним последовательностям, наблюдаемым сегодня. ASR использовался для исследования причинной мутации, которая привела к неофункционализации белка.после дублирования, сначала определив, что указанная мутация была расположена между предками «5» и «4» на диаграмме (иллюстративно) с помощью функциональных анализов. [6] В области биофизики белков ASR также использовался для изучения развития термодинамических и кинетических ландшафтов белка в течение эволюционного времени, а также путей сворачивания белка путем объединения многих современных аналитических методов, таких как HX / MS . [7] Такого рода идеи обычно выводятся из нескольких предков, реконструированных в рамках филогении - со ссылкой на предыдущую аналогию, путем изучения узлов все выше и выше (все дальше и дальше назад во времени эволюции) в пределах древа жизни. [8]

Большинство исследований ASR проводятся in vitro и выявили наследственные свойства белков, которые кажутся желательными с эволюционной точки зрения, такие как повышенная термостабильность, каталитическая активность и каталитическая неразборчивость. Эти данные были аккредитованы для артефактов алгоритмов ASR, а также для показательных иллюстраций окружающей среды древней Земли - часто исследования ASR должны дополняться обширными средствами контроля (обычно альтернативными экспериментами ASR) для смягчения алгоритмических ошибок. Не все изученные белки ASR демонстрируют это так называемое «наследственное превосходство». [9] Зарождающаяся область « эволюционной биохимии».'был поддержан недавним увеличением исследований ASR с использованием предков в качестве способов проверки приспособленности организма в определенных клеточных контекстах - эффективного тестирования предковых белков in vivo . [8] Из-за неотъемлемых ограничений такого рода исследований - в первую очередь из-за отсутствия подходящих древних геномов, подходящих для этих предков, небольшого репертуара хорошо классифицированных лабораторных модельных систем и неспособности имитировать древнюю клеточную среду; было проведено очень мало исследований ASR in vivo . Несмотря на вышеупомянутые препятствия, предварительное понимание этого направления исследований из статьи 2015 года показало, что наблюдаемое `` наследственное превосходство '' in vitro не воспроизводилось in vivo.данного белка. [10] ASR представляет собой один из немногих механизмов для изучения биохимии докембрийской эры жизни (> 541 млн лет назад ) и поэтому часто используется в « палеогенетике »; действительно, Цукерандл и Полинг изначально планировали, что ASR станет отправной точкой в ​​области, которую они назвали «палеобиохимией».

Методология [ править ]

Выбирают и выравнивают несколько родственных гомологов интересующего белка при множественном выравнивании последовательностей (MSA), строят « филогенетическое дерево » со статистически выведенными последовательностями в узлах ветвей. Именно эти последовательности являются так называемыми «предками» - процесс синтеза соответствующей ДНК, преобразования ее в клетку и производства белка является так называемой «реконструкцией». Последовательности предков обычно рассчитываются по максимальному правдоподобию , однако байесовскиетакже реализованы методы. Поскольку предки выводятся из филогении, топология и состав филогении играет главную роль в выходных последовательностях ASR. Учитывая, что существует много дискуссий и дискуссий о том, как построить филогении - например, являются ли термофильные бактерии базовыми или производными в бактериальной эволюции, - многие статьи ASR конструируют несколько филогений с различной топологией и, следовательно, с разными последовательностями ASR. Эти последовательности затем сравниваются и часто несколько (~ 10) экспрессируются и изучаются на филогенетический узел. ASR не претендует на воссоздание фактической последовательности древнего белка / ДНК, а скорее последовательности, которая, вероятно, будет похожа на ту, которая действительно была в узле. Это не считается недостатком ASR, поскольку он вписывается в `` нейтральную сеть ''.'модель эволюции белка, согласно которой в эволюционных стыках (узлах) в существующей популяции организма существовала популяция генотипически различных, но фенотипически сходных белковых последовательностей. Следовательно, возможно, что ASR будет генерировать одну из последовательностей нейтральной сети узла, и хотя он может не представлять генотип последнего общего предка современных последовательностей, он, скорее всего, представляет фенотип. [8] Это подтверждается современными наблюдениями, согласно которым многие мутации в некаталитическом / функциональном сайте белка вызывают незначительные изменения биофизических свойств. Следовательно, ASR позволяет исследовать биофизические свойства прошлых белков и свидетельствует о древней генетике.

Методы максимального правдоподобия (ML) работают путем генерации последовательности, в которой остаток в каждой позиции, по прогнозам, с наибольшей вероятностью займет указанную позицию с помощью используемого метода вывода - обычно это матрица оценок (аналогичная тем, которые используются в BLAST или MSA. ) рассчитывается по существующим последовательностям. Альтернативные методы включают максимальную экономию (MP), которые создают последовательность на основе модели эволюции последовательности - обычно идея о том, что минимальное количество изменений нуклеотидной последовательности представляет собой наиболее эффективный путь эволюции, и с помощью бритвы Оккама.наиболее вероятно. MP часто считается наименее надежным методом реконструкции, поскольку он, возможно, упрощает эволюцию до степени, неприменимой в масштабе миллиарда лет.

Другой метод включает рассмотрение неопределенности остатка - так называемые байесовские методы - эта форма ASR иногда используется в дополнение к методам машинного обучения, но обычно дает более неоднозначные последовательности. В ASR термин «неоднозначность» относится к положениям остатков, в которых нельзя предсказать четкую замену - часто в этих случаях создается несколько последовательностей ASR, охватывающих большинство неоднозначностей и сравниваемых друг с другом. ML ASR часто требует дополнительных экспериментов, чтобы показать, что производные последовательности представляют собой нечто большее, чем просто консенсусы входных последовательностей. Это особенно необходимо при наблюдении «превосходства предков». [7]Одно из объяснений тенденции к повышению термостабильности состоит в том, что ML ASR создает согласованную последовательность нескольких различных параллельных механизмов, эволюционировавших для обеспечения термостабильности минорных белков на протяжении всей филогении, что приводит к аддитивному эффекту, приводящему к «превосходной» наследственной термостабильности. [11]

Выражение консенсусных последовательностей и параллельный ASR с помощью методов, не связанных с ML, часто требуется, чтобы опровергнуть эту теорию в каждом эксперименте. Еще одна проблема, вызываемая методами ML, заключается в том, что скоринговые матрицы получены из современных последовательностей, и конкретные частоты аминокислот, наблюдаемые сегодня, могут не совпадать с докембрийской биологией, что приводит к искаженному выводу последовательности. В нескольких исследованиях пытались построить древние скоринговые матрицы с помощью различных методологий и сравнивали полученные последовательности и биофизические свойства их белков. Хотя эти модифицированные последовательности приводят к несколько отличающимся последовательностям ASR, наблюдаемые биофизические свойства, по-видимому, не отличаются вне экспериментальной ошибки. [12]Из-за «целостной» природы ASR и большой сложности, которая возникает при рассмотрении всех возможных источников экспериментальной ошибки - экспериментальное сообщество считает окончательным измерением надежности ASR сравнение нескольких альтернативных реконструкций ASR одного и того же узла и выявление сходных биофизических свойств. Хотя этот метод не предлагает надежной статистической, математической меры надежности, он основывается на фундаментальной идее, используемой в ASR, о том, что отдельные аминокислотные замены не вызывают значительных изменений биофизических свойств в белке. чтобы уметь преодолевать эффект неоднозначности вывода. [13]

Кандидаты, используемые для ASR, часто выбираются на основе конкретного изучаемого свойства, представляющего интерес, например термостабильности. [9] Путем выбора последовательностей с любого конца диапазона свойств (например, психрофильных белков и термофильных белков), но в пределахВ семействе белков ASR можно использовать для исследования конкретных изменений последовательностей, которые вызывают наблюдаемый биофизический эффект, например, стабилизирующие взаимодействия. Представьте на диаграмме, что если последовательность «А» кодирует белок, который был оптимально функциональным при нейтральных значениях pH, а «D» - в кислых условиях, изменения последовательности между «5» и «2» могут проиллюстрировать точное биофизическое объяснение этой разницы. Поскольку эксперименты ASR могут извлекать предков, которым, вероятно, миллиарды лет, часто происходят десятки, если не сотни изменений последовательностей между самими предками и предками и существующими последовательностями - из-за этого такие эволюционные исследования функций последовательности могут потребовать много работы и рациональное направление. [1] [6] [14]

Воскрешенные белки [ править ]

Есть много примеров предковых белков, которые были реконструированы с помощью вычислений, экспрессированы в живых клеточных линиях и - во многих случаях - очищены и изучены биохимически. Лаборатория Торнтона заметно воскресила несколько рецепторов предковых гормонов (примерно с 500 млн. Лет назад) [15] [16] [17] и в сотрудничестве с лабораторией Стивенса воскресили древние субъединицы V-АТФазы [18] из дрожжей (800 млн. Лет). Marqusee лаборатория недавно опубликовал несколько исследований , касающихся эволюции биофизических истории кишечной палочки рибонуклеазы H1 . [9] [19]Другими примерами являются зрительные пигменты предков позвоночных [20], ферменты дрожжей, расщепляющие сахара (800Ma); [21] ферменты бактерий , обеспечивающие устойчивость к антибиотикам (2–3 млрд лет ); [22] рибонуклеазы, участвующие в пищеварении жвачных животных; и алкогольдегидрогеназы (Adhs), участвующие в ферментации дрожжей (~ 85Ma). [13] «Возраст» реконструированной последовательности определяется с помощью модели молекулярных часов , и часто используются несколько. [7] [23]Этот метод датирования часто калибруется с использованием геологических точек времени (таких как составляющие древнего океана или BIF ), и хотя эти часы предлагают единственный метод определения возраста очень древнего белка, они имеют большие пределы погрешности и не позволяют защитить от противоречивых данных. С этой целью ASR «возраст» действительно следует использовать только как ориентировочную характеристику и часто вообще превосходит его для измерения количества замен между предковыми и современными последовательностями (основание, на котором рассчитываются часы). [9] При этом использование часов позволяет сравнивать наблюдаемые биофизические данные белка ASR с геологической или экологической средой в то время. Например, исследования ASR на бактериальном EF-Tus(белки, участвующие в трансляции , которые, вероятно, редко подвергаются HGT и обычно демонстрируют Tms на ~ 2 ° C больше, чем Tenv ) указывают на более горячую докембрийскую Землю, что очень хорошо согласуется с геологическими данными о температурах древнего земного океана на основе изотопных уровней кислорода-18 . [12] исследование ASR дрожжевого ADHS показывает , что появление subfunctionalized ADHS для метаболизма этанола (не просто отходы экскреции) возникло в то время , похожее на зарю мясистых фруктов в кембрийском период , и что до этого появления, Аз служил Выделяют этанол как побочный продукт избытка пирувата . [13]Использование часов также, возможно, указывает на то, что зарождение жизни произошло до того, как самые ранние молекулярные окаменелости указали (> 4,1 Га), но, учитывая спорную надежность молекулярных часов, к таким наблюдениям следует относиться с осторожностью. [23] [24]

Тиоредоксин [ править ]

Одним из примеров является реконструкция ферментов тиоредоксина из организмов возрастом до 4 миллиардов лет. [25] В то время как химическая активность этих реконструированных ферментов была удивительно похожа на современные ферменты, их физические свойства показали значительно повышенную термическую и кислотную стабильность. Эти результаты были интерпретированы как предполагающие, что древняя жизнь могла развиться в океанах, которые были намного более горячими и кислыми, чем сегодня. [25]

Значение [ править ]

Эти эксперименты затрагивают различные важные вопросы эволюционной биологии: идет ли эволюция маленькими шагами или большими скачками; обратима ли эволюция; как развивается сложность ? Было показано, что небольшие мутации в аминокислотной последовательности рецепторов гормонов определяют важное изменение их предпочтений в отношении гормонов. Эти изменения означают огромные шаги в эволюции эндокринной системы . Таким образом, очень небольшие изменения на молекулярном уровне могут иметь огромные последствия. Лаборатория Торнтона также смогла показать, что эволюция необратима, изучая рецептор глюкокортикоидов.. Этот рецептор был изменен семью мутациями в рецепторе кортизола, но обращение этих мутаций не вернуло исходный рецептор. Это указывает на то, что эпистаз играет важную роль в эволюции белка - наблюдение, которое в сочетании с наблюдениями за несколькими примерами параллельной эволюции поддерживает упомянутую выше модель нейтральной сети. [8] Другие более ранние нейтральные мутации действовали как храповик и сделали изменения рецептора необратимыми. [26] Эти различные эксперименты с рецепторами показывают, что в ходе своей эволюции белки сильно дифференцируются, и это объясняет, как может развиваться сложность. Более пристальный взгляд на различные рецепторы предковых гормонов и различныегормоны показывает, что на уровне взаимодействия между отдельными аминокислотными остатками и химическими группами гормонов возникают очень небольшие, но специфические изменения. Знание об этих изменениях может, например, привести к синтезу гормональных эквивалентов, способных имитировать или подавлять действие гормона, что может открыть возможности для новых методов лечения.

Учитывая, что ASR выявила тенденцию к древней термостабильности и ферментативной неразборчивости, ASR представляет собой ценный инструмент для белковых инженеров, которые часто стремятся к этим чертам (производя эффекты, иногда превосходящие существующие, рационально ведущие инструменты). [11] ASR также обещает «воскресить» фенотипически похожие «древние организмы», что, в свою очередь, позволит эволюционным биохимикам исследовать историю жизни. Сторонники ASR, такие как Беннер, заявляют, что благодаря этим и другим экспериментам в конце текущего века мы увидим уровень понимания биологии, аналогичный тому, который возник в классической химии в прошлом веке. [13]

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б Торнтон, JW (2004). «Воскрешая древние гены: экспериментальный анализ вымерших молекул». Природа Обзоры Генетики . 5 (5): 366–375. DOI : 10.1038 / nrg1324 . PMID  15143319 . S2CID  205482979 .
  2. ^ Полинг, Л. и Цукеркандл, Э. Химическая палеогенетика: исследования молекулярного восстановления вымерших форм жизни. Acta Chem. Сканд. supl. 17, S9 – S16 (1963) Онлайн-архив Acta Chemica Scandinavica
  3. ^ Джерманн, TM; Opitz, JG; Стэкхаус, Дж; Беннер, С.А. (март 1995 г.). «Реконструкция эволюционной истории надсемейства парнокопытных рибонуклеаз». Природа . 374 (6517): 57–9. Bibcode : 1995Natur.374 ... 57J . DOI : 10.1038 / 374057a0 . PMID 7532788 . S2CID 4315312 .  
  4. ^ Торнтон, JW; Потребность, E; Crews, D (сентябрь 2003 г.). «Возрождение предкового стероидного рецептора: древнее происхождение передачи сигналов эстрогена». Наука . 301 (5640): 1714–7. Bibcode : 2003Sci ... 301.1714T . DOI : 10.1126 / science.1086185 . PMID 14500980 . S2CID 37628350 .  
  5. ↑ Пирсон, Хелен (21 марта 2012 г.) « Доисторические белки: воскрешение мертвых » Природа (Лондон)
  6. ^ a b Андерсон, Дуглас П .; Whitney, Dustin S .; Хэнсон-Смит, Виктор; Возница, Ариэль; Камподонико-Бернетт, Уильям; Фолькман, Брайан Ф .; Король, Николь; Торнтон, Джозеф В .; Прехода, Кеннет Э. (07.01.2016). «Эволюция древней функции белка, участвующей в организованной многоклеточности у животных» . eLife . 5 : e10147. DOI : 10.7554 / eLife.10147 . ISSN 2050-084X . PMC 4718807 . PMID 26740169 .   
  7. ^ a b c Уиллер, Лукас С .; Lim, Shion A .; Маркиз, Сьюзен; Хармс, Майкл Дж. (01.06.2016). «Термостабильность и специфичность древних белков» . Текущее мнение в структурной биологии . 38 : 37–43. DOI : 10.1016 / j.sbi.2016.05.015 . ISSN 1879-033X . PMC 5010474 . PMID 27288744 .   
  8. ^ a b c d Хармс, Майкл Дж .; Торнтон, Джозеф В. (1 августа 2013 г.). «Эволюционная биохимия: раскрытие исторических и физических причин свойств белка» . Природа Обзоры Генетики . 14 (8): 559–571. DOI : 10.1038 / nrg3540 . ISSN 1471-0056 . PMC 4418793 . PMID 23864121 .   
  9. ^ a b c d Лим, Шион А .; Харт, Кэтрин М .; Хармс, Майкл Дж .; Маркиз, Сьюзан (15.11.2016). «Эволюционная тенденция к кинетической стабильности траектории сворачивания РНКаз H» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (46): 13045–13050. DOI : 10.1073 / pnas.1611781113 . ISSN 1091-6490 . PMC 5135364 . PMID 27799545 .   
  10. ^ Хоббс, Джоан К .; Прентис, Эрика Дж .; Груссен, Матье; Аркус, Викери Л. (01.10.2015). «Реконструированные предковые ферменты накладывают дополнительную плату на современные бактерии, несмотря на то, что демонстрируют благоприятные биохимические свойства» . Журнал молекулярной эволюции . 81 (3–4): 110–120. Bibcode : 2015JMolE..81..110H . DOI : 10.1007 / s00239-015-9697-5 . ЛВП : 1721,1 / 105120 . ISSN 1432-1432 . PMID 26349578 . S2CID 18833850 .   
  11. ^ a b Risso, Valeria A .; Gavira, Jose A .; Санчес-Руис, Хосе М. (01.06.2014). «Термостабильные и неразборчивые докембрийские белки». Экологическая микробиология . 16 (6): 1485–1489. DOI : 10.1111 / 1462-2920.12319 . ISSN 1462-2920 . PMID 25009840 .  
  12. ^ a b Гоше, Эрик А .; Говиндараджан, Шридхар; Ганеш, Омджой К. (07.02.2008). «Палеотемпературный тренд докембрийской жизни на основе воскрешенных белков». Природа . 451 (7179): 704–707. Bibcode : 2008Natur.451..704G . DOI : 10,1038 / природа06510 . ISSN 0028-0836 . PMID 18256669 . S2CID 4311053 .   
  13. ^ a b c d Реконструкция последовательности предков . Оксфорд, Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. 2007-07-26. ISBN 9780199299188.
  14. ^ Рисунок 1 из ссылки Harms, Michael J .; Торнтон, Джозеф В. (1 августа 2013 г.). «Эволюционная биохимия: раскрытие исторических и физических причин свойств белка» . Природа Обзоры Генетики . 14 (8): 559–571. DOI : 10.1038 / nrg3540 . PMC 4418793 . PMID 23864121 .  
  15. ^ Торнтон, JW; Потребность, E; Экипажи, Д. (2003). «Воскрешение рецепторов стероидов предков: древнее происхождение сигналов эстрогена». Наука . 301 (5640): 1714–1717. Bibcode : 2003Sci ... 301.1714T . DOI : 10.1126 / science.1086185 . PMID 14500980 . S2CID 37628350 .  
  16. ^ Эйк, GN; Colucci, JK; Хармс, MJ; Орлунд, EA; Торнтон, Дж. В. (2012). «Эволюция минимальной специфичности и неразборчивости рецепторов стероидных гормонов» . PLOS Genetics . 8 (11): e1003072. DOI : 10.1371 / journal.pgen.1003072 . PMC 3499368 . PMID 23166518 .  
  17. ^ Хармс MJ, Eick GN, Goswami D, Colucci JK, Griffin PR, Ortlund EA, Thornton JW. (2013) Биофизические механизмы мутаций с большим эффектом в эволюции рецепторов стероидных гормонов. Труды Национальной академии наук США. опубликовано в сети 24 июня
  18. ^ Финниган, G; Hanson-Smith, V; Стивенс, TH; Торнтон, Дж. В. (2012). «Механизмы эволюции повышенной сложности в молекулярной машине» . Природа . 481 (7381): 360–4. Bibcode : 2012Natur.481..360F . DOI : 10,1038 / природа10724 . PMC 3979732 . PMID 22230956 .  
  19. ^ Харт, Кэтрин М .; Хармс, Майкл Дж .; Schmidt, Bryan H .; Эля, Кэролайн; Торнтон, Джозеф В .; Маркиз, Сьюзен (11 ноября 2014 г.). «Дрейф термодинамической системы в эволюции белков» . PLOS Биология . 12 (11): e1001994. DOI : 10.1371 / journal.pbio.1001994 . ISSN 1545-7885 . PMC 4227636 . PMID 25386647 .   
  20. ^ Ши, Й .; Ёкояма, С. (2003). «Молекулярный анализ эволюционного значения ультрафиолетового зрения у позвоночных» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 100 (14): 8308–8313. Bibcode : 2003PNAS..100.8308S . DOI : 10.1073 / pnas.1532535100 . PMC 166225 . PMID 12824471 .  
  21. ^ Voordeckers, K; Браун, Калифорния; Ваннест, К; van der Zande, E; Voet, A; и другие. (2012). «Реконструкция предковых метаболических ферментов выявляет молекулярные механизмы, лежащие в основе эволюционных инноваций посредством дупликации генов» . PLOS Biol . 10 (12): e1001446. DOI : 10.1371 / journal.pbio.1001446 . PMC 3519909 . PMID 23239941 .  
  22. ^ Риссо, Вирджиния; Jose, AG; Мехиа-Кармона, ДФ; Gauchier, EA; Санчес-Руис, Дж. М. (2013). «Гиперстабильность и неоднородность субстрата в лабораторных воскрешения докембрийских β-лактамаз». Варенье. Chem. Soc . 135 (8): 2899–2902. DOI : 10.1021 / ja311630a . PMID 23394108 . S2CID 207092445 .  
  23. ^ a b Battistuzzi, Fabia U; Фейжао, Андрей; Хеджес, С. Блэр (2004-11-09). «Геномная шкала времени эволюции прокариот: понимание происхождения метаногенеза, фототрофии и колонизации земли» . BMC Evolutionary Biology . 4 : 44. DOI : 10.1186 / 1471-2148-4-44 . ISSN 1471-2148 . PMC 533871 . PMID 15535883 .   
  24. ^ Белл, Элизабет А .; Бёнке, Патрик; Харрисон, Т. Марк; Мао, Венди Л. (24 ноября 2015 г.). «Потенциально биогенный углерод, сохранившийся в цирконе возрастом 4,1 миллиарда лет» . Труды Национальной академии наук . 112 (47): 14518–14521. Bibcode : 2015PNAS..11214518B . DOI : 10.1073 / pnas.1517557112 . ISSN 0027-8424 . PMC 4664351 . PMID 26483481 .   
  25. ^ a b Перес-Хименес, Рауль; Альваро Инглес-Прието; Цзы-Мин Чжао; Инмакулада Санчес-Ромеро; Хорхе Алегри-Себоллада; Паллав Косури; Сержи Гарсиа-Маньяс; Т. Джозеф Каппок; Масару Танокура; Арне Хольмгрен; Хосе М. Санчес-Руис; Эрик Гоше; Хулио М. Фернандес (3 апреля 2011 г.). «Палеоэнзимология одиночных молекул исследует химию воскрешенных ферментов» . Структурная и молекулярная биология природы . 18 (5): 592–6. DOI : 10.1038 / nsmb.2020 . PMC 3087858 . PMID 21460845 .  
  26. ^ Бриджем, JT; Ортлунд, EA; Торнтон, Дж. В. (2009). «Эпистатический храповик ограничивает направление эволюции рецепторов глюкокортикоидов» . Природа . 461 (7263): 515–519. Bibcode : 2009Natur.461..515B . DOI : 10,1038 / природа08249 . PMC 6141187 . PMID 19779450 .