Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Масс-спектрометр, используемый для высокопроизводительного анализа белков.

Масс-спектрометрия белков - это применение масс-спектрометрии для изучения белков . Масс-спектрометрия - важный метод точного определения массы и характеристики белков, и для его многочисленных применений были разработаны различные методы и приборы. Его приложения включают идентификацию белков и их посттрансляционных модификаций , выяснение белковых комплексов, их субъединиц и функциональных взаимодействий, а также глобальное измерение белков в протеомике . Его также можно использовать для локализации белков в различных органеллах и определения взаимодействия между различными белками, а также с липидами мембран. [1] [2]

Двумя основными методами, используемыми для ионизации белка в масс-спектрометрии, являются ионизация электрораспылением (ESI) и матричная лазерная десорбция / ионизация (MALDI). Эти методы ионизации используются в сочетании с масс-анализаторами, такими как тандемная масс-спектрометрия . Как правило, белок анализируется либо методом « сверху вниз », при котором белки анализируются неповрежденными, либо подходом « снизу вверх », при котором белок сначала расщепляется на фрагменты. Иногда также может использоваться промежуточный подход «середины вниз», в котором анализируются более крупные пептидные фрагменты.

История [ править ]

Применение масс-спектрометрии для изучения белков стало популярным в 1980-х годах после разработки MALDI и ESI . Эти методы ионизации сыграли важную роль в характеристике белков. (MALDI) Матричная лазерная десорбционная ионизация была изобретена в конце 80-х Францем Хилленкампом и Майклом Карасом . [3] Хилленкамп, Карас и их коллеги-исследователи смогли ионизировать аминокислоту аланин , смешав ее с аминокислотой триптофаном и облучив импульсным лазером с длиной волны 266 нм. [3] Несмотря на важность, прорыв произошел только в 1987 году. В 1987 году Коичи Танакаиспользовали метод «ультратонкий металл плюс жидкая матрица» и ионизированные биомолекулы размером 34 472 Да протеина карбоксипептидазы-A. [4]

В 1968 году Малкольм Доул сообщил о первом применении ионизации электрораспылением с масс-спектрометрией. Примерно в то же время, когда MALDI стал популярен, Джон Беннетт Фенн был процитирован за разработку ионизации электрораспылением. [5] [6] Коичи Танака получил Нобелевскую премию по химии 2002 года вместе с Джоном Фенном и Куртом Вютрихом «за разработку методов идентификации и структурного анализа биологических макромолекул». [7] Эти методы ионизации значительно облегчили изучение белков с помощью масс-спектрометрии. Следовательно, масс-спектрометрия белков теперь играет ведущую роль в характеристике белков.

Методы и подходы [ править ]

Методы [ править ]

Масс-спектрометрия белков требует, чтобы белки в растворе или твердом состоянии были превращены в ионизированную форму в газовой фазе, прежде чем они будут введены и ускорены в электрическом или магнитном поле для анализа. Двумя основными методами ионизации белков являются ионизация электрораспылением (ESI) и матричная лазерная десорбция / ионизация.(МАЛДИ). В электроспрее ионы создаются из белков в растворе, и это позволяет хрупким молекулам ионизироваться в целости и сохранности, иногда сохраняя нековалентные взаимодействия. В MALDI белки встроены в матрицу, обычно в твердой форме, а ионы создаются импульсами лазерного света. Электрораспыление производит больше многозарядных ионов, чем MALDI, что позволяет измерять белки с высокой массой и улучшать фрагментацию для идентификации, в то время как MALDI работает быстро и с меньшей вероятностью подвергается воздействию загрязняющих веществ, буферов и добавок. [8]

Анализ массы всего белка в основном проводится с использованием либо времяпролетной (TOF) MS, либо ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FT-ICR). Эти два типа инструментов здесь предпочтительны из-за их широкого диапазона масс, а в случае FT-ICR, его высокой точности измерения массы. Ионизация белка электрораспылением часто приводит к образованию нескольких заряженных частиц с 800 < m / z <2000, и результирующий спектр можно деконволютировать, чтобы определить среднюю массу белка с точностью до 50 ppm или лучше с использованием инструментов TOF или ионных ловушек .

Массовый анализ протеолитических пептидов - популярный метод характеристики белков, поскольку для характеристики можно использовать более дешевые конструкции инструментов. Кроме того, подготовка образцов становится проще, когда целые белки перевариваются на более мелкие пептидные фрагменты. Наиболее широко используемым инструментом для анализа пептидной массы являются инструменты MALDI-TOF, поскольку они позволяют получать отпечатки пептидной массы (PMF) с высокой скоростью (1 PMF можно проанализировать примерно за 10 секунд). Многоступенчатая квадрупольная времяпролетная ловушка и квадрупольная ионная ловушка также находят применение в этом приложении.

Хроматографический след и МС / МС спектры пептида.

Тандемная масс-спектрометрия (МС / МС) используется для измерения спектров фрагментации и идентификации белков с высокой скоростью и точностью. Диссоциация, вызванная столкновением, используется в основных приложениях для создания набора фрагментов из определенного пептидного иона. Процесс фрагментации в первую очередь приводит к образованию продуктов расщепления, которые разрываются по пептидным связям. Из-за этой простоты фрагментации можно использовать наблюдаемые массы фрагментов для сопоставления с базой данных предсказанных масс для одной из многих заданных пептидных последовательностей. Тандемная МС целых белков-ионов была недавно исследована с использованием диссоциации с захватом электронов и продемонстрировала обширную информацию о последовательности в принципе, но не является обычной практикой.

Подходы [ править ]

В соответствии с характеристиками и диапазоном масс доступных масс-спектрометров для характеристики белков используются два подхода. В первом случае интактные белки ионизируются любым из двух описанных выше методов, а затем вводятся в масс-анализатор. Этот подход называется стратегией анализа белков « сверху вниз », поскольку он включает в себя начало всей массы, а затем ее разделение. Однако нисходящий подход в основном ограничивается низкопроизводительными исследованиями отдельных белков из-за проблем, связанных с обработкой целых белков, их неоднородностью и сложностью их анализа. [8]

Во втором подходе, называемом МС « снизу вверх », белки ферментативно расщепляются на более мелкие пептиды с использованием протеазы, такой как трипсин . Затем эти пептиды вводят в масс-спектрометр и идентифицируют с помощью масс-спектрометрии пептидов или тандемной масс-спектрометрии . Следовательно, этот подход использует идентификацию на уровне пептидов, чтобы сделать вывод о существовании белков, собранных вместе, с обнаружением повторов de novo . [9]Более мелкие и более однородные фрагменты легче анализировать, чем интактные белки, и их также можно определить с высокой точностью, поэтому этот «восходящий» подход является предпочтительным методом исследований в протеомике. Еще один подход, который начинает применяться, - это промежуточный подход «середины вниз», при котором анализируются протеолитические пептиды, размер которых превышает размер типичных триптических пептидов. [8]

Фракционирование белков и пептидов [ править ]

Протокол масс-спектрометрии

Представляющие интерес белки обычно являются частью сложной смеси множества белков и молекул, сосуществующих в биологической среде. Это создает две важные проблемы. Во-первых, два метода ионизации, используемые для больших молекул, работают хорошо только тогда, когда смесь содержит примерно равные количества материала, тогда как в биологических образцах разные белки, как правило, присутствуют в сильно различающихся количествах. Если такая смесь ионизируется электрораспылением или MALDI, более многочисленные виды имеют тенденцию «заглушать» или подавлять сигналы от менее массовых. Во-вторых, масс-спектр сложной смеси очень сложно интерпретировать из-за огромного количества компонентов смеси. Это усугубляется тем фактом, что ферментативное расщепление белка приводит к образованию большого количества пептидных продуктов.

В свете этих проблем для разделения белков широко используются методы одно- и двумерного гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Первый метод фракционирует целые белки с помощью двумерного гель-электрофореза . Первым измерением 2D-геля является изоэлектрическая фокусировка (IEF). В этом измерении белок разделен его изоэлектрической точкой (pI), а второе измерение - электрофорез в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Этот размер разделяет белок в соответствии с его молекулярной массой. [10]По завершении этого этапа происходит расщепление в геле. В некоторых ситуациях может потребоваться сочетание обоих этих методов. Пятна геля, обнаруженные на 2D-геле, обычно связаны с одним белком. Если требуется идентичность белка, обычно применяется метод расщепления в геле , при котором интересующее белок пятно вырезается и протеолитически переваривается. Массы пептидов, полученные в результате расщепления, можно определить масс-спектрометрией с использованием масс-спектрометрии пептидов . Если эта информация не позволяет однозначно идентифицировать белок, его пептиды могут быть подвергнуты тандемной масс-спектрометрии для секвенирования de novo.. Небольшие изменения массы и заряда можно обнаружить с помощью 2D-PAGE. Недостатками этого метода являются его небольшой динамический диапазон по сравнению с другими методами, некоторые белки по-прежнему трудно разделить из-за их кислотности, основности, гидрофобности и размера (слишком большого или слишком малого). [11]

Второй метод, высокоэффективная жидкостная хроматография , используется для фракционирования пептидов после ферментативного расщепления. Характеристика белковых смесей с помощью ВЭЖХ / МС также называется протеомикой дробовика и MuDPIT (технология многомерной идентификации белков). Пептидную смесь, полученную в результате переваривания белковой смеси, фракционируют с помощью одной или двух стадий жидкостной хроматографии. Элюент со стадии хроматографии может быть либо непосредственно введен в масс-спектрометр посредством ионизации электрораспылением, либо нанесен на серию небольших пятен для последующего масс-анализа с использованием MALDI.

Приложения [ править ]

Идентификация белков [ править ]

Есть два основных способа использования МС для идентификации белков. Фингерпринт массы пептидов использует массы протеолитических пептидов в качестве входных данных для поиска в базе данных прогнозируемых масс, которые могут возникнуть в результате переваривания списка известных белков. Если последовательность белка в справочном списке дает значительное количество предсказанных масс, которые соответствуют экспериментальным значениям, есть некоторые свидетельства того, что этот белок присутствовал в исходном образце. Таким образом, этапы очистки ограничивают возможности метода массового снятия отпечатков пептидов. Фингерпринт пептидных масс может быть получен с помощью МС / МС. [9]

МС также является предпочтительным методом идентификации посттрансляционных модификаций белков, поскольку он более выгоден, чем другие подходы, такие как методы на основе антител. [1]

De novo (пептидное) секвенирование [ править ]

Основная статья: De novo пептидное секвенирование

Последовательность пептидов de novo для масс-спектрометрии обычно выполняется без предварительного знания аминокислотной последовательности. Это процесс назначения аминокислот из пептидных фрагментов масс одного белка . Секвенирование de novo оказалось успешным для подтверждения и расширения результатов поиска в базе данных.

Поскольку de novo секвенирование основано на массе и некоторые аминокислоты имеют идентичные массы (например, лейцин и изолейцин ), точное ручное секвенирование может быть затруднено. Следовательно, может быть необходимо использовать приложение поиска гомологии последовательностей для работы в тандеме между поиском в базе данных и секвенированием de novo для устранения этого присущего ограничения.

Преимущество поиска в базе данных состоит в том, что они быстро определяют последовательности, если они уже задокументированы в базе данных. Другие неотъемлемые ограничения поиска в базе данных включают модификации / мутации последовательностей (некоторые поиски в базе данных не учитывают адекватным образом изменения в «задокументированной» последовательности, поэтому может быть упущена ценная информация), неизвестность (если последовательность не задокументирована, она не будет найдена. ), ложных срабатываний, неполных и поврежденных данных. [12]

Аннотированная спектральная библиотека пептидов также может быть использована в качестве эталона для идентификации белков / пептидов. Он предлагает уникальную силу сокращенного пространства поиска и повышенной специфичности. Ограничения включают в себя то, что спектры, не включенные в библиотеку, не будут идентифицированы, спектры, собранные с разных типов масс-спектрометров, могут иметь довольно разные характеристики, а эталонные спектры в библиотеке могут содержать шумовые пики, которые могут привести к ложноположительной идентификации. [13] Был описан ряд различных алгоритмических подходов для идентификации пептидов и белков с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС / МС), секвенирования пептидов de novo и поиска на основе тегов последовательности. [14]

Количественное определение белка [ править ]

Основная статья: количественная протеомика
Количественная масс-спектрометрия.

Множественные методы позволяют количественно определять количество белков с помощью масс-спектрометрии ( количественная протеомика ) [15], а недавние достижения позволили количественно определить тысячи белков в отдельных клетках. [16] [17] Как правило, стабильно (например нерадиоактивный) более тяжелые изотопы из углерода ( 13 С) или азота ( 15 N) включены в одну выборку , а другой маркирован с соответствующими легкими изотопами (например , 12 ° С и 14 N). [18]Два образца смешивают перед анализом. Пептиды, полученные из разных образцов, можно различить по разнице в массе. Отношение интенсивностей их пиков соответствует относительному содержанию пептидов (и белков). Наиболее популярными методами мечения изотопов являются SILAC (мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток), мечение 18 O, катализируемое трипсином , ICAT ( аффинное мечение с изотопным кодом), iTRAQ (изобарические метки для относительного и абсолютного количественного определения). [19] «Полуколичественная» масс-спектрометрия может выполняться без маркировки образцов. [20]Обычно это делается с помощью анализа MALDI (в линейном режиме). Интенсивность пика или площадь пика отдельных молекул (обычно белков) здесь коррелирует с количеством белка в образце. Однако индивидуальный сигнал зависит от первичной структуры белка, сложности образца и настроек прибора. Другие типы количественной масс-спектрометрии «без меток» используют спектральные подсчеты (или подсчеты пептидов) расщепленных белков в качестве средства для определения относительных количеств белка. [12]

Определение структуры белка [ править ]

Характеристики, указывающие на трехмерную структуру белков, можно исследовать с помощью масс-спектрометрии различными способами. [21] Используя химическое сшивание, чтобы соединить части белка, которые расположены близко в пространстве, но далеко друг от друга по порядку, можно получить информацию об общей структуре. Наблюдая за обменом протонов амида с дейтерием из растворителя, можно исследовать доступность растворителя для различных частей белка. [22] Масс-спектрометрия с водородно-дейтериевым обменом используется для изучения белков и их конформаций уже более 20 лет. Этот тип структурного анализа белков может быть подходящим для белков, которые сложно использовать другими структурными методами.[23] Еще одним интересным направлением в изучении структуры белков является ковалентное мечение, индуцированное лазером. В этом методе открытые для растворителя участки белка модифицируются гидроксильными радикалами. Его комбинация с быстрым перемешиванием использовалась в исследованиях сворачивания белков. [24]

Протеогеномика [ править ]

В том, что сейчас обычно называют протеогеномикой , пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии , используются для улучшения аннотаций генов (например, сайтов запуска генов) и аннотаций белков. Параллельный анализ генома и протеома облегчает обнаружение посттрансляционных модификаций и протеолитических событий [25], особенно при сравнении нескольких видов. [26]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Юрген Кокс и Маттиас Манн (июль 2011 г.). «Количественная протеомика высокого разрешения для системной биологии, управляемой данными» . Ежегодный обзор биохимии . 80 : 273–299. DOI : 10.1146 / annurev-biochem-061308-093216 . PMID  21548781 .CS1 maint: использует параметр авторов ( ссылка ) - через Annual Reviews (требуется подписка)
  2. ^ Нельсон П. Баррера и Кэрол В. Робинсон (июль 2011 г.). «Достижения в масс-спектрометрии мембранных белков: от индивидуальных белков до интактных комплексов». Ежегодный обзор биохимии . 80 : 247–71. DOI : 10.1146 / annurev-biochem-062309-093307 . ЛВП : 10533/135572 . PMID 21548785 . CS1 maint: использует параметр авторов ( ссылка ) - через Annual Reviews (требуется подписка)
  3. ^ а б Карась, М .; Бахманн, Д .; Хилленкамп, Ф. (1985). «Влияние длины волны в ультрафиолетовой лазерной десорбционной масс-спектрометрии органических молекул с высоким уровнем излучения». Аналитическая химия . 57 (14): 2935–9. DOI : 10.1021 / ac00291a042 .
  4. ^ Карась, М .; Бахманн, Д .; Bahr, U .; Хилленкамп, Ф. (1987). «Матричная ультрафиолетовая лазерная десорбция нелетучих соединений». Международный журнал масс-спектрометрии и ионных процессов . 78 : 53–68. Bibcode : 1987IJMSI..78 ... 53K . DOI : 10.1016 / 0168-1176 (87) 87041-6 .
  5. Перейти ↑ Dole M, Mack LL, Hines RL, Mobley RC, Ferguson LD, Alice MB (1968). «Молекулярные пучки макроионов». Журнал химической физики . 49 (5): 2240–2249. Bibcode : 1968JChPh..49.2240D . DOI : 10.1063 / 1.1670391 .
  6. ^ Бирендра Н. Праманик; А.К. Гангулы; Майкл Л. Гросс (28 февраля 2002 г.). Прикладная электрораспылительная масс-спектрометрия: серия практической спектроскопии . CRC Press . С. 4–. ISBN 978-0-8247-4419-9.
  7. ^ "Пресс-релиз: Нобелевская премия по химии 2002" . Нобелевский фонд. 2002-10-09 . Проверено 2 апреля 2011 .
  8. ^ a b c Chait, Брайан Т. (2011). «Масс-спектрометрия в постгеномную эпоху». Анну Рев Биохим . 80 : 239–46. DOI : 10.1146 / annurev-biochem-110810-095744 . PMID 21675917 .  - через Annual Reviews (требуется подписка)
  9. ^ а б Траугер, А. Суня; W. Webb; Сюздак Г. (2002). «Пептидно-белковый анализ с масс-спектрометрией» . Спектроскопия . 16 (1): 15–28. DOI : 10.1155 / 2002/320152 .
  10. Перейти ↑ W. Wells, G. Wang & SJ Baek (2006). «Сравнительное исследование трех протеомных количественных методов, DIGE, cICAT и iTRAQ, с использованием 2D Gel- или LC-MALDI TOF / TOF». Журнал протеомных исследований . 5 (3): 651–658. CiteSeerX 10.1.1.156.5802 . DOI : 10.1021 / pr050405o . PMID 16512681 .  
  11. ^ Issaq, J. Халим & TD Веенстра (2008). «Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE): достижения и перспективы» . Биотехнологии . 46 (5): 697–700. DOI : 10.2144 / 000112823 . PMID 18474047 . 
  12. ^ a b Брет, Купер, Дж. Фен и У. Гаррет (2010). «Относительное количественное определение белка без метки: статистика ошибок спектрального подсчета из девяти реплицируемых образцов MudPIT» . Спектроскопия . 21 (9): 1534–1546. DOI : 10.1016 / j.jasms.2010.05.001 . PMID 20541435 . 
  13. ^ Augustin, Scalbert и Л. Бреннан и О. Fiehn (2009). «Метаболомика на основе масс-спектрометрии: ограничения и рекомендации для будущего прогресса с особым упором на исследования в области питания» . NCBI . 5 (4): 435–458. DOI : 10.1007 / s11306-009-0168-0 . PMC 2794347 . PMID 20046865 .  
  14. ^ П. Эрнандес, М. Мюллер и Р. Д. Аппель (2006). «Автоматическая идентификация белков с помощью тандемной масс-спектрометрии: проблемы и стратегии». Обзоры масс-спектрометрии . 25 (2): 235–254. Bibcode : 2006MSRv ... 25..235H . DOI : 10.1002 / mas.20068 . PMID 16284939 . 
  15. ^ Cravatt, Бенджамин Ф .; Саймон, Габриэль М .; Йетс III, Джон Р. (декабрь 2007 г.). «Биологическое влияние протеомики на основе масс-спектрометрии» . Природа . 450 (7172): 991–1000. DOI : 10,1038 / природа06525 . ISSN 1476-4687 . PMID 18075578 . S2CID 205211923 .   
  16. ^ Славы Николай (2021-02-01). «Одноклеточный анализ белков с помощью масс-спектрометрии» . Текущее мнение в химической биологии . 60 : 1–9. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2020.04.018 . ISSN 1367-5931 . PMID 32599342 .  
  17. ^ Славы Николай (2020-01-31). «Открытие протеома в одиночных клетках» . Наука . 367 (6477): 512–513. DOI : 10.1126 / science.aaz6695 . ISSN 0036-8075 . PMC 7029782 . PMID 32001644 .   
  18. ^ Снайдерс А.П., де Вос MG, Райт PC (2005). «Новый подход к количественному определению и секвенированию пептидов на основе метаболического мечения 15N и 13C». J. Proteome Res . 4 (2): 578–85. DOI : 10.1021 / pr0497733 . PMID 15822937 . 
  19. ^ М. Мияги и ТСК Rao (2007). «Протеолитические 18 O-меченные стратегии для количественной протеомики». Обзоры масс-спектрометрии . 26 (1): 121–136. Bibcode : 2007MSRv ... 26..121M . DOI : 10.1002 / mas.20116 . PMID 17086517 . 
  20. Перейти ↑ Haqqani AS, Kelly JF, Stanimirovic DB (2008). «Количественное профилирование белков с помощью масс-спектрометрии с использованием протеомики без метки». Протоколы геномики . Методы молекулярной биологии. 439 . С. 241–56. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-188-8_17 . ISBN 978-1-58829-871-3. PMID  18370108 .
  21. ^ Z. Zhang; Д. Л. Смит (1994). «Исследование нековалентных структурных особенностей белков методом масс-спектрометрии». Обзоры масс-спектрометрии . 13 (5–6): 411–429. Bibcode : 1994MSRv ... 13..411S . DOI : 10.1002 / mas.1280130503 .
  22. Перейти ↑ TE Wales & JR Engen (2006). «Водородообменная масс-спектрометрия для анализа динамики белков». Обзоры масс-спектрометрии . 25 (1): 158–170. Bibcode : 2006MSRv ... 25..158W . DOI : 10.1002 / mas.20064 . PMID 16208684 . 
  23. ^ RE Якоба и JR Энген (2012). "Масс-спектрометрия с водородным обменом: мы вышли из зыбучих песков?" . Обзоры масс-спектрометрии . 23 (6): 1003–1010. Bibcode : 2012JASMS..23.1003I . DOI : 10.1007 / s13361-012-0377-Z . PMC 3389995 . PMID 22476891 .  
  24. ^ BB Stocks & L. Konermann (2009). «Структурная характеристика короткоживущих промежуточных продуктов разворачивания белков с помощью лазерно-индуцированного окислительного мечения и масс-спектрометрии». Анальный. Chem. 81 (1): 20–27. DOI : 10.1021 / ac801888h . PMID 19055350 .  
  25. ^ Гупта Н .; Tanner S .; Jaitly N .; Adkins JN; Lipton M .; Эдвардс Р .; Romine M .; Остерман А .; Bafna V .; Smith RD; и другие. (2007). «Полнопротеомный анализ посттрансляционных модификаций: применение масс-спектрометрии для протеогеномной аннотации» . Genome Res . 17 (9): 1362–1377. DOI : 10.1101 / gr.6427907 . PMC 1950905 . PMID 17690205 .  
  26. ^ Гупта Н .; Benhamida J .; Bhargava V .; Goodman D .; Каин Э .; Kerman I .; Nguyen N .; Ollikainen N .; Родригес Дж .; Ван Дж .; и другие. (2008). «Сравнительная протеогеномика: сочетание масс-спектрометрии и сравнительной геномики для анализа нескольких геномов» . Genome Res . 18 (7): 1133–1142. DOI : 10.1101 / gr.074344.107 . PMC 2493402 . PMID 18426904 .