Темно - гаситель (также известный как темная присоска ) представляет собой вещество , которое поглощает энергию возбуждения от флуорофора и рассеивает энергию как тепло ; в то время как типичный (флуоресцентный) гаситель излучает большую часть этой энергии в виде света . [1] Темные тушители используются в молекулярной биологии вместе с флуорофорами. Когда они находятся близко друг к другу, например, в молекуле или белке, излучение флуорофора подавляется. Этот эффект можно использовать для изучения геометрии и движения молекул.
Примером его использования является TaqMan или анализ захватчиков, методы генотипирования SNP . Например, используется шпилька с флуорофором и гасителем в основании стержня. Немеченый SNP-специфический праймер для ПЦР (один из многих) со специфическим 5'-концом связывается с исследуемой последовательностью, а taq-полимераза удлиняет последовательность, которая будет иметь специфический 5'-конец в зависимости от SNP (нечувствительна к полиморфизму перед рассматриваемый SNP). В следующем цикле удлиняется праймер , дополняющий этот хвост, со шпилькой. В следующем прогоне удлинение дополнительной нити приведет к линеаризации шпильки, разделяющей флуорофор и гаситель.. Альтернативой использованию тушителей является использование FRET, когда комбинация двух красителей дает сигнал. [2]
Режим работы
Темные тушители - это красители без собственной флуоресценции . До последних нескольких лет гасители обычно представляли собой второй флуоресцентный краситель, например флуоресцеин в качестве репортера и тетраметилродамин в качестве гасителя (зонды FAM / TAM). Однако гасящая флуоресценция может увеличивать фоновый шум из-за перекрытия спектров гасящей и репортерной флуоресценции. Это ограничение часто требует использования сложного анализа данных и оптических фильтров. Темные гасители предлагают решение этой проблемы, потому что они не занимают полосу излучения. Кроме того, темные тушители позволяют мультиплексировать (когда два или более зондов репортер-тушитель используются вместе).
Флуоресцентные красители поглощают свет, что переводит краситель в возбужденное состояние; краситель возвращается в основное состояние из возбужденного состояния, испуская свет (флуоресценция). В системе репортер-тушитель краситель безызлучательно (без света) передает энергию тушителю. Это возвращает краситель в основное состояние и генерирует возбужденное состояние тушителя. Затем гаситель возвращается в основное состояние за счет эмиссионного затухания ( флуоресценция ) или безызлучательного действия (тушение в темноте). При безызлучательном или темновом распаде энергия выделяется посредством молекулярных колебаний (тепла). При типичной концентрации зонда в мкМ или менее тепло от безызлучательного распада слишком мало, чтобы повлиять на температуру раствора.
Примеры темных тушителей
- Дабсил (диметиламиноазобензолсульфоновая кислота) абсорбируется в зеленом спектре и часто используется с флуоресцеином. (Дабсил имеет почти идентичную абсорбцию, но вместо сукцинимидилового эфира имеет сульфонилхлорид для образования более стабильных конъюгатов).
- Тушители черных дыр способны гасить во всем видимом спектре.
- Тушители Qxl охватывают весь видимый спектр.
- Iowa black FQ поглощает в желто-зеленой части спектра.
- Черный RQ Айовы блокируется в оранжево-красной части спектра.
- IRDye QC-1 тушит красители от видимого до ближнего инфракрасного диапазона (500-900 нм). [3]
Рекомендации
- ^ Остерман, Х., Следующий шаг в ближней инфракрасной флуоресценции: IRDye QC-1 Dark Quencher, 2009; Обзорная статья. Скачать PDF, заархивированный 13 июля 2011 г., на Wayback Machine
- ^ Пэн, X., Chen, H., Draney, DR, Волчек, WM, A Non-флуоресцентный Широкий диапазон утоления Краситель для FRET, Assays Analytical Biochemistry, 2009; (Том 388), стр. 220–228. Скачать PDF, заархивированный 13 июля 2011 г., на Wayback Machine
- ^ Peng, X., Draney, DR, Volcheck, WM, Погашенный флуоресцентный пептидный субстрат ближнего инфракрасного диапазона для анализа протеазы ВИЧ-1, Proc. SPIE, 2006; (6097), [1] [ постоянная мертвая ссылка ]
дальнейшее чтение
- Дж. Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии , 2-е изд., Пленум, Нью-Йорк, 1999 .
- Johansson, MK; Кук, RM (2003). «Внутримолекулярные димеры: новая стратегия дизайна для зондов с тушением флуоресценции». Chem. Евро. Дж . 9 (15): 3466–3471. DOI : 10.1002 / chem.200304941 . PMID 12898673 .