Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

TaqMan зонды гидролиз зонды , которые предназначены для увеличения специфичности количественной ПЦР . Впервые этот метод был описан в 1991 году исследователем Кэри Муллис из Cetus Corporation [1], а впоследствии технология была разработана Hoffmann-La Roche для диагностических тестов и Applied Biosystems (теперь часть Thermo Fisher Scientific ) для исследовательских приложений.

Принцип зонда TaqMan основан на 5´ – 3´ экзонуклеазной активности Taq- полимеразы по расщеплению зонда с двойной меткой во время гибридизации с комплементарной последовательностью-мишенью и детекции на основе флуорофора . [2] Как и в других количественных методах ПЦР , результирующий сигнал флуоресценции позволяет количественно измерить накопление продукта во время экспоненциальных стадий ПЦР; однако зонд TaqMan значительно увеличивает специфичность обнаружения. Зонды TaqMan были названы в честь видеоигры Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan), поскольку ее механизм основан на принципе Pac-Man.[3]

Принцип [ править ]

Химический механизм зонда TaqMan

Зонды TaqMan состоят из флуорофора, ковалентно присоединенного к 5'-концу олигонуклеотидного зонда, и гасителя на 3'-конце. [4] Несколько различных флуорофоров (например , 6-карбоксифлуоресцеин , акроним: FAM , или tetrachlorofluorescein, акроним: ТЕТЫ) и гасители (например , тетраметили родамин , акроним: TAMRA) доступен. [5] Молекула гасителя гасит флуоресценцию, излучаемую флуорофором, когда возбуждается источником света циклера посредством резонансной передачи энергии Ферстера (FRET). [6] Пока флуорофор и гаситель находятся рядом, гашение подавляет любые сигналы флуоресценции.

Зонды TaqMan сконструированы таким образом, что они отжигаются в области ДНК, амплифицированной определенным набором праймеров. (В отличие от диаграммы, зонд связывается с одноцепочечной ДНК.) Зонды TaqMan могут быть конъюгированы с фрагментом связывания с малой бороздкой (MGB), дигидроциклопирролоиндолтрипептидом (DPI 3 ), чтобы повысить его аффинность связывания с последовательностью-мишенью; Зонды, конъюгированные с MGB, имеют более высокую температуру плавления (T m ) из-за повышенной стабилизации сил Ван-дер-Ваальса. Поскольку полимераза Taq удлиняет праймер и синтезирует растущую цепь (опять же, на однонитевой матрице, но в направлении, противоположном показанному на диаграмме, то есть от 3 'до 5' комплементарной цепи), 5 ' к 3 ' экзонуклеазеАктивность полимеразы Taq разрушает зонд, отожженный до матрицы. Разложение зонда высвобождает флуорофор из него и нарушает близость к тушителю, тем самым ослабляя эффект гашения и позволяя флуоресценцию флуорофора. Следовательно, флуоресценция, обнаруженная в термоциклере для количественной ПЦР , прямо пропорциональна высвобожденному флуорофору и количеству матрицы ДНК, присутствующей в ПЦР.

Приложения [ править ]

Анализы на основе зондов TaqMan широко используются в количественной ПЦР в исследовательских и медицинских лабораториях :

  • Анализы экспрессии генов
  • Фармакогеномика
  • Генотипирование лейкоцитарного антигена человека (HLA)
  • Определение вирусной нагрузки в клинических образцах ( ВИЧ , гепатит )
  • Бактериальная идентификация [7] анализов
  • Количественная оценка ДНК
  • SNP-генотипирование
  • Проверка результатов микрочипа

См. Также [ править ]

  • Количественная ПЦР
  • SYBR Зеленый
  • Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
  • Молекулярный маяк
  • Экспрессия гена

Примечания и ссылки [ править ]

  1. ^ Голландия, PM; Abramson, RD; Watson, R .; Гельфанд Д.Х. (1991). «Обнаружение продукта специфической полимеразной цепной реакции с использованием 5 '---- 3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Thermus aquaticus» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 88 (16): 7276–7280. Bibcode : 1991PNAS ... 88.7276H . DOI : 10.1073 / pnas.88.16.7276 . PMC  52277 . PMID  1871133 .
  2. ^ Экспрессия гена TaqMan - Проекты NCBI
  3. ^ The Real-Time TaqMan PCR and Applications in Veterinary Medicine - From PacMan to TaqMan - компьютерная игра повторно. Архивировано 5 мая 2009 г. на Wayback Machine.
  4. ^ TaqMan Probes: Введение, функционирование и применение
  5. ^ Kutyavin И. В., Афонин И. А., Миллс А, Горн В.В., Lukhtanov Е.А., Белоусы Е.С., Зингер МДж, Walburger ДК, Лохи С.Г., Галл А.А., Dempcy R, Рид МВт, Мейер РБ, Hedgpeth J (2000). «Связывающие ДНК-зонды с 3'-минорной бороздкой повышают специфичность последовательности при температурах удлинения ПЦР» . Nucleic Acids Res . 28 (2): 655–661. DOI : 10.1093 / NAR / 28.2.655 . PMC 102528 . PMID 10606668 .  
  6. ^ Bustin SA (октябрь 2000). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени» . J. Mol. Эндокринол . 25 (2): 169–93. DOI : 10,1677 / jme.0.0250169 . PMID 11013345 . 
  7. ^ AlleleID - Дизайн анализа для идентификации бактерий

Внешние ссылки [ править ]

1. Ресурсы TaqMan RT-PCR - базы данных праймеров, программное обеспечение, протоколы [ мертвая ссылка ]
2. Beacon Designer - Программное обеспечение для разработки праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, включая праймеры SYBR Green, зонды TaqMan, молекулярные маяки.