В области молекулярной биологии и биотехнологии , A флуоресцентные метки , также известные как флуоресцентная метка или флуоресцентный зонд , представляют собой молекула , которая присоединена к химически помощи в обнаружении биомолекул , такие как белки, антитело, или аминокислоте. Обычно флуоресцентное мечение или мечение использует реактивное производное флуоресцентной молекулы, известное как флуорофор . Флуорофор селективно связывается с определенной областью или функциональной группой на молекуле-мишени и может быть присоединен химически или биологически. [1] Различные методы маркировки, такие как ферментативная маркировка,маркировка белков и генетическая маркировка широко используются. Бромид этидия , флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок являются общими метками. Наиболее часто меченые молекулы - это антитела, белки, аминокислоты и пептиды, которые затем используются в качестве специфических зондов для обнаружения конкретной мишени. [2]
История
Разработка методов обнаружения и идентификации биомолекул была мотивирована возможностью улучшить изучение молекулярной структуры и взаимодействий. До появления флуоресцентного мечения радиоизотопы использовались для обнаружения и идентификации молекулярных соединений. С тех пор были разработаны более безопасные методы, которые включают использование флуоресцентных красителей или флуоресцентных белков в качестве меток или зондов в качестве средства для мечения и идентификации биомолекул. [3] Хотя флуоресцентное мечение в этом отношении использовалось только недавно, открытие флуоресценции происходит гораздо дольше.
Сэр Джордж Стокс разработал закон флуоресценции Стокса в 1852 году, согласно которому длина волны флуоресцентного излучения больше, чем длина волны возбуждающего излучения. Ричард Мейер затем назвал флуорофор в 1897 году, чтобы описать химическую группу, связанную с флуоресценцией. С тех пор флуоресцеин был создан Адольфом фон Байером в качестве флуоресцентного красителя в 1871 году, а метод окрашивания был разработан и использован с развитием флуоресцентной микроскопии в 1911 году [4].
Бромид этидия и его варианты были разработаны в 1950-х годах [4], а в 1994 году были введены флуоресцентные белки или FP. [5] Зеленый флуоресцентный белок, или GFP, был открыт Осаму Шимомурой в 1960-х годах и был разработан как индикаторная молекула Дугласом Прашером в 1987 году. [6] FP привели к прорыву в визуализации живых клеток с возможностью выборочной маркировки участков генетического белка. и наблюдать функции и механизмы белков. [5] За этот прорыв Шимомура был удостоен Нобелевской премии в 2008 году. [7]
Были разработаны новые методы отслеживания биомолекул, включая использование колориметрических биосенсоров, фотохромных соединений, биоматериалов и электрохимических сенсоров. Флуоресцентная маркировка также является распространенным методом, в котором применяется ферментативная маркировка, химическая маркировка, маркировка белков и генетическая маркировка. [1]
Методы отслеживания биомолекул
В настоящее время существует несколько методов маркировки биомолекул. Некоторые из методов включают следующее.
Изотопные маркеры
Обычные виды, для которых используются изотопные маркеры, включают белки. В этом случае аминокислоты со стабильными изотопами углерода, азота или водорода включаются в полипептидные последовательности. [8] Эти полипептиды затем подвергаются масс-спектрометрии . Благодаря точно определенному изменению, которое эти изотопы вызывают в пептидах, по графику спектрометрии можно определить, какие пептиды содержат изотопы. Таким образом можно извлечь интересующий белок из нескольких других в группе. Изотопные соединения играют важную роль как фотохромы, описанные ниже.
Колориметрические биосенсоры
Биосенсоры прикрепляются к интересующему веществу. Обычно это вещество не может поглощать свет, но с присоединенным биосенсором свет может поглощаться и излучаться на спектрофотометре . [9] Кроме того, флуоресцентные биосенсоры можно увидеть невооруженным глазом. Некоторые флуоресцентные биосенсоры также могут изменять цвет в изменяющейся среде (например, с синего на красный). Исследователь сможет исследовать и получать данные об окружающей среде на основе того, какой цвет он или она может видеть визуально у гибридных видов биосенсора и молекулы. [10]
Колориметрические анализы обычно используются для определения того, какая концентрация одного вида по сравнению с другим. [9]
Фотохромные соединения
Фотохромные соединения могут переключаться между диапазоном или множеством цветов. Их способность отображать разные цвета зависит от того, как они поглощают свет. Различные изомерные проявления молекулы поглощают свет с разной длиной волны, так что каждый изомерный вид может отображать свой цвет в зависимости от своего поглощения. К ним относятся соединения с фотопереключением, которые представляют собой белки, которые могут переключаться из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное в определенных условиях. [11]
Наиболее распространенной органической молекулой, используемой в качестве фотохрома, является диарилетен . [12] Другие примеры фотосопереключаемых белков включают PADRON-C, rs-FastLIME-s и bs-DRONPA-s, которые можно использовать как в клетках растений, так и в клетках млекопитающих, чтобы наблюдать, как клетки перемещаются в различные среды. [11]
Биоматериалы
Флуоресцентные биоматериалы - это возможный способ использования внешних факторов для более заметного наблюдения за ходом пути. Метод включает флуоресцентное маркирование пептидных молекул, которые могут изменить естественный путь организма. Когда этот пептид вводится в клетку организма, он может вызвать другую реакцию. Этот метод можно использовать, например, для лечения пациента, а затем наглядно увидеть результат лечения. [13]
Электрохимические датчики
Электрохимические датчики могут использоваться для определения биомолекул без маркировки. Они обнаруживают изменения и измеряют ток между исследуемым металлическим электродом и электролитом, содержащим целевой аналит. Затем к электроду прикладывается известный потенциал от тока обратной связи, и результирующий ток может быть измерен. Например, один метод, использующий электрохимическое зондирование, включает медленное повышение напряжения, вызывающее окисление или восстановление химических веществ на электроде. График зависимости тока ячейки от напряжения позволяет в конечном итоге определить количество химических веществ, потребляемых или производимых на электроде. [14] Флуоресцентные метки могут использоваться вместе с электрохимическими датчиками для облегчения обнаружения в биологической системе.
Флуоресцентные этикетки
Из различных методов мечения биомолекул флуоресцентные метки имеют преимущество в том, что они очень чувствительны даже при низкой концентрации и не разрушают структуру и функцию молекулы-мишени. [1]
Зеленый флуоресцентный белок - это встречающийся в природе флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria, который широко используется для маркировки представляющих интерес белков. GFP излучает фотон в зеленой области светового спектра при возбуждении за счет поглощения света. Хромофор состоит из окисленного трипептида -Ser ^ 65-Тир ^ 66-Кли ^ 67 , расположенный в пределах беты барреля. GFP катализирует окисление и требует только молекулярного кислорода. GFP был изменен путем изменения длины волны поглощаемого света, чтобы включить другие цвета флуоресценции. YFP или желтый флуоресцентный белок , BFP или синий флуоресцентный белок и CFP или голубой флуоресцентный белок являются примерами вариантов GFP. Эти варианты получены с помощью генной инженерии гена GFP. [15]
Синтетические флуоресцентные зонды также можно использовать в качестве флуоресцентных меток. Преимущества этих этикеток заключаются в меньшем размере и большем разнообразии цветов. Их можно использовать для более избирательной маркировки представляющих интерес белков с помощью различных методов, включая маркировку на основе химического распознавания, такую как использование меток для хелатирующих металлы пептидов, и маркировку на основе биологического распознавания с использованием ферментативных реакций. [16] Однако, несмотря на широкий спектр длин волн возбуждения и излучения, а также лучшую стабильность, синтетические зонды имеют тенденцию быть токсичными для клетки и поэтому обычно не используются в исследованиях визуализации клеток. [1]
Флуоресцентные метки можно гибридизировать с мРНК, чтобы помочь визуализировать взаимодействие и активность, например локализацию мРНК. Антисмысловая цепь, меченная флуоресцентным зондом, присоединяется к одной цепи мРНК, и затем ее можно рассматривать во время развития клетки, чтобы увидеть движение мРНК внутри клетки. [17]
Флуорогенные этикетки
Флуороген - это лиганд (флуорогенный лиганд), который сам по себе не является флуоресцентным, но когда он связан определенным белком или структурой РНК, становится флуоресцентным. [18]
Например, FAST представляет собой вариант фотоактивного желтого белка, который был сконструирован для связывания химических имитаторов трипептидного хромофора GFP. [19] Аналогичным образом, аптамер шпината представляет собой сконструированную последовательность РНК, которая может связывать химические имитаторы хромофора GFP, тем самым обеспечивая условную и обратимую флуоресценцию молекулам РНК, содержащим последовательность. [20]
Использование меток в флуоресцентной маркировке
Флуоресцентная маркировка известна своей неразрушающей природой и высокой чувствительностью. Это сделало его одним из наиболее широко используемых методов маркировки и отслеживания биомолекул. [1] В зависимости от природы мишени можно использовать несколько методов флуоресцентного мечения.
Ферментативная маркировка
При ферментативной маркировке сначала формируется конструкция ДНК с использованием гена и ДНК флуоресцентного белка. [21] После транскрипции образуется гибрид РНК + флуоресцентный. Интересующий объект прикреплен к ферменту, который может распознавать эту гибридную ДНК. Обычно в качестве флуорофора используют флуоресцеин или биотин.
Химическая маркировка
Химическая маркировка или использование химических меток использует взаимодействие между небольшой молекулой и определенной генетической аминокислотной последовательностью. [22] Химическая маркировка иногда используется в качестве альтернативы GFP. Синтетические белки, которые функционируют как флуоресцентные зонды, меньше, чем у GFP, и поэтому могут функционировать как зонды в более разнообразных ситуациях. Кроме того, они предлагают более широкий диапазон цветов и фотохимических свойств. [23] Благодаря недавним достижениям в области химической маркировки, химические метки предпочтительнее флуоресцентных белков из-за архитектурных и размерных ограничений характерного β-ствола флуоресцентного белка. Изменения флуоресцентных белков могут привести к потере флуоресцентных свойств. [22]
Маркировка белков
При маркировке белков используется короткая метка, чтобы свести к минимуму нарушение сворачивания и функции белка. Переходные металлы используются для связывания определенных остатков в метках с сайт-специфическими мишенями, такими как N-концы, C-концы или внутренние сайты в белке. Примеры тегов, используемых для маркировки белков, включают теги биомышьяка, теги гистидина и теги FLAG. [1]
Генетическая маркировка
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является примером метода генетической маркировки, в котором используются зонды, специфичные для участков хромосомы по длине хромосомы, также известной как окраска хромосом . Множественные флуоресцентные красители, каждый из которых имеет различную длину волны возбуждения и излучения, связываются с зондом, который затем гибридизуется с хромосомами. Флуоресцентный микроскоп может обнаруживать присутствующие красители и отправлять их на компьютер, который может выявить кариотип клетки. Этот метод позволяет выявить такие аномалии, как делеции и дупликации. [24]
Клеточная визуализация
Химические метки были адаптированы для технологий визуализации в большей степени, чем флуоресцентные белки, потому что химические метки могут локализовать фотосенсибилизаторы ближе к целевым белкам. [25] Затем белки могут быть помечены и обнаружены с помощью визуализации, такой как микроскопия сверхвысокого разрешения , Ca 2+ -изображение , определение pH, обнаружение перекиси водорода, световая инактивация с помощью хромофора и многофотонная световая микроскопия. Исследования изображений in vivo на живых животных были выполнены впервые с использованием мономерного белка, полученного из бактериальной галоалкандегалогеназы, известного как Halo-tag. [22] [26] Halo-tag ковалентно связывается со своим лигандом и позволяет лучше экспрессировать растворимые белки. [26]
Преимущества
Хотя флуоресцентные красители могут не обладать такой же чувствительностью, как радиоактивные зонды, они способны в реальном времени показывать активность молекул в действии. [27] Более того, радиация и надлежащее обращение больше не вызывают беспокойства.
С развитием флуоресцентного мечения флуоресцентная микроскопия позволила визуализировать специфические белки как на фиксированных, так и на живых изображениях клеток. Локализация определенных белков привела к появлению важных концепций в клеточной биологии, таких как функции отдельных групп белков в клеточных мембранах и органеллах. При визуализации живых клеток флуоресцентные метки позволяют отслеживать перемещения белков и их взаимодействия. [24]
Последние достижения в методах, включающих флуоресцентные метки, привели к визуализации мРНК и ее локализации в различных организмах. Визуализация РНК в живых клетках может быть достигнута путем введения синтезированной РНК, которая химически связана с флуоресцентной меткой, в живые клетки с помощью микроинъекции. Этот метод был использован, чтобы показать, как мРНК oskar в эмбрионе Drosophila локализуется в задней области ооцита . [17]
Смотрите также
- Велосиметрия с молекулярным мечением
- Спектрофотометр для измерения нуклеиновых кислот
- Белковые метки
Заметки
- ^ a b c d e f Саху, Харекрушна (1 января 2012 г.). «Методы флуоресцентного мечения в биомолекулах: воспоминание». RSC Advances . 2 (18): 7017–7029. DOI : 10.1039 / C2RA20389H .
- ^ «Флуоресцентное мечение биомолекул с помощью органических зондов - Презентации - PharmaXChange.info» . 29 января 2011 г.
- ^ Гвинн и Пейдж, Питер и Гай. «Тенденции лабораторных технологий: флуоресценция + маркировка» . Наука . Проверено 10 марта 2013 года .
- ^ а б Кричка Л.Дж., Фортина П. (апрель 2009 г.). «Аналитическое происхождение:« первые »в флуоресцентной маркировке нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот» . Клиническая химия . 55 (4): 670–83. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.116152 . PMID 19233914 .
- ^ а б Цзин С., корнуоллский VW (сентябрь 2011 г.). «Химические метки для маркировки белков внутри живых клеток» . Счета химических исследований . 44 (9): 784–92. DOI : 10.1021 / ar200099f . PMC 3232020 . PMID 21879706 .
- ^ «Зеленый флуоресцентный белок - История GFP - Осаму Шимомура» .
- ^ Шимомура, Осаму. «Нобелевская премия по химии» . Проверено 5 апреля 2013 года .
- ^ Чен X, Смит Л.М., Брэдбери Е.М. (март 2000 г.). «Site-specific mass tagging со стабильными изотопами в белках для точной и эффективной идентификации белков». Аналитическая химия . 72 (6): 1134–43. DOI : 10.1021 / ac9911600 . PMID 10740850 .
- ^ а б «Колориметрические анализы» . Проверено 3 апреля 2013 года .
- ^ Halevy, Revital; София Колушеваль; Роберт Э. У. Хэнкок; Раз Елинек (2002). «Колориметрические биосенсорные везикулы для биотехнологических применений» (PDF) . Материалы симпозиума Общества исследования материалов . 724. Биологические и биомиметические материалы - от свойств к функциям . Проверено 4 апреля 2013 года .
- ^ а б Lummer M, Humpert F, Wiedenlübbert M, Sauer M, Schüttpelz M, Staiger D (сентябрь 2013 г.). «Новый набор обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков для использования в трансгенных растениях» . Молекулярный завод . 6 (5): 1518–30. DOI : 10.1093 / MP / sst040 . PMID 23434876 .
- ^ Перье А., Морель Ф, Жакмен Д. (август 2012 г.). «Мультифотохромизм одиночных молекул с диарилэтенами». Счета химических исследований . 45 (8): 1173–82. DOI : 10.1021 / ar200214k . PMID 22668009 .
- ^ Чжан И, Ян Дж (январь 2013 г.). «Стратегии проектирования флуоресцентных биоразлагаемых полимерных биоматериалов» . Журнал Materials Chemistry B . 1 (2): 132–148. DOI : 10.1039 / C2TB00071G . PMC 3660738 . PMID 23710326 .
- ^ "bioee.ee.columbia.edu" (PDF) . Архивировано из оригинального (PDF) 20 декабря 2012 года.
- ^ Кокс, Майкл; Нельсон, Дэвид Р .; Ленингер, Альберт Л (2008). Принципы биохимии Ленингера . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-7108-1.
- ^ Чон Д., Мин К., Чжон Дж, Чан В., Квон И (май 2013 г.). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Молекулярные биосистемы . 9 (5): 862–72. DOI : 10.1039 / c2mb25422k . PMID 23318293 .
- ^ а б Weil TT, Parton RM, Davis I (июль 2010 г.). «Сделать сообщение ясным: визуализация локализации мРНК» . Тенденции в клеточной биологии . 20 (7): 380–90. DOI : 10.1016 / j.tcb.2010.03.006 . PMC 2902723 . PMID 20444605 .
- ^ Сент-Дьёрджи С., Шмидт Б.Ф., Шмидт Б.А., Кригер Й., Фишер Г.В., Закель К.Л., Адлер С., Фицпатрик Дж. А., Вулфорд Калифорния, Ян К., Васильев К. В., Бергет П. Б., Бручез депутат, Джарвик Дж. В., Вагонер А. . «Флуороген-активирующие одноцепочечные антитела для визуализации белков клеточной поверхности». Природная биотехнология (Аннотация). 26 (2): 235–40. DOI : 10.1038 / nbt1368 . PMID 18157118 .
Мы сообщаем здесь о разработке белков-репортеров, которые генерируют флуоресценцию из темных молекул (флуорогенов).
- ^ Пламон М.А., Биллон-Дени Э., Маурин С., Гаурон С., Пимента Ф.М., Шпехт К.Г., Ши Дж., Керард Дж., Пан Б., Россиньол Д., Монкок К., Морелле Н., Волович М., Лескоп Э., Чен Ю., Триллер А. Вриз С., Ле Со Т., Жюльен Л., Готье А. (январь 2016 г.). «Малая метка, активирующая флуоресценцию и изменяющая абсорбцию для настраиваемой визуализации белков in vivo» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (3): 497–502. Bibcode : 2016PNAS..113..497P . DOI : 10.1073 / pnas.1513094113 . PMC 4725535 . PMID 26711992 .
- ^ Пейдж Дж.С., Ву К.Ю., Яффри С.Р. (июль 2011 г.). «РНК-имитаторы зеленого флуоресцентного белка» . Наука . 333 (6042): 642–6. Bibcode : 2011Sci ... 333..642P . DOI : 10.1126 / science.1207339 . PMC 3314379 . PMID 21798953 .
- ^ Рихтер А., Швагер С., Хентце С., Ансорге В., Хентце М. В., Мукенталер М. (сентябрь 2002 г.). «Сравнение методов маркировки ДНК флуоресцентными метками, используемых для анализа экспрессии с помощью ДНК-микрочипов» (PDF) . Биотехнологии . 33 (3): 620-8, 630. DOI : 10,2144 / 02333rr05 . PMID 12238772 .
- ^ а б в Вомбахер Р., Корнуолл VW (июнь 2011 г.). «Химические метки: применение в визуализации флуоресценции живых клеток» . Журнал биофотоники . 4 (6): 391–402. DOI : 10.1002 / jbio.201100018 . PMID 21567974 .
- ^ Чон Д., Мин К., Чжон Дж, Чан В., Квон И (май 2013 г.). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Молекулярные биосистемы . 9 (5): 862–72. DOI : 10.1039 / C2MB25422K . PMID 23318293 .
- ^ а б Мэтью П. Скотт; Лодиш, Харви Ф .; Арнольд Берк; Кайзер, Крис; Монти Кригер; Энтони Бретчер; Хидде Плоег; Анжелика Амон (2012). Молекулярная клеточная биология . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-1-4292-3413-9.
- ^ Эттингер, А (2014). «Флуоресцентная визуализация живых клеток» . Методы клеточной биологии . 123 : 77–94. DOI : 10.1016 / B978-0-12-420138-5.00005-7 . ISBN 9780124201385. PMC 4198327 . PMID 24974023 .
- ^ а б Н. Петерсон С., Квон К. (2012). «HaloTag: улучшение экспрессии растворимости и применение в функциональном анализе белков» . Современная химическая геномика . 6 (1): 8–17. DOI : 10.2174 / 1875397301206010008 . PMC 3480702 . PMID 23115610 .
- ^ Прудников Д., Мирзабеков А. (ноябрь 1996 г.). «Химические методы флуоресцентного мечения ДНК и РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 24 (22): 4535–42. DOI : 10.1093 / NAR / 24.22.4535 . PMC 146275 . PMID 8948646 .