Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Вторичная структура минимального шпилечного рибозима со связанной субстратной РНК. Кружки обозначают отдельные нуклеотиды, а линии обозначают канонические пары оснований (Ватсона-Крика).

Шпилька рибозим представляет собой небольшой участок РНК , которые могут выступать в качестве рибозима . Как и рибозим «голова молота», он обнаружен в РНК- спутниках вирусов растений. Впервые он был идентифицирован в минус нити вируса табачной кольцевой пятнистости (ИСКО) сателлитной РНК , где она катализирует саморасщепление и соединение ( лигирования ) реакцию для обработки продуктов прокатки репликации вируса круга в линейные и круговом спутнике РНК молекул. Рибозим «шпилька» похож на рибозим «головка молотка» в том, что для реакции ему не требуется иона металла.

Биологическая функция [ править ]

Рибозим шпильки представляет собой мотив РНК, который катализирует реакции процессинга РНК, необходимые для репликации молекул сателлитной РНК, в которые он встроен. Эти реакции являются самообрабатывающими, то есть молекула перестраивает свою собственную структуру. Реакции как расщепления, так и концевого соединения опосредуются рибозимным мотивом, что приводит к смеси взаимопревращаемых линейных и кольцевых молекул-сателлитов. Эти реакции важны для обработки больших мультимерных молекул РНК, которые генерируются репликацией по катящемуся кругу . В конце цикла репликации эти большие промежуточные продукты репликации сателлитной РНК обрабатываются до молекул единичной длины (кольцевой или линейной), прежде чем они могут быть упакованы вирусами и перенесены в другие клетки для дальнейших циклов репликации. [1]

Сворачивание шпилечного рибозима в его природную третичную структуру. Последовательность рибозима показана серым цветом, а последовательность субстрата - светло-красным. Сайт расщепления и лигирования (темно-красный) находится между нуклеотидами A-1 и G + 1. Показаны важные последовательности внутри петель A и B, с черными точками, указывающими на взаимодействия между нуклеотидами, не связанные с Ватсоном-Криком. Два каталитических нуклеотида показаны зеленым цветом, а критический нуклеотид C25, который образует пару оснований Уотсона-Крика с G + 1 на участке реакции, показан синим. [2]

Натуральные и искусственные варианты рибозима шпильки [ править ]

Рибозим шпильки был идентифицирован только в трех встречающихся в природе последовательностях:

Меньшие искусственные версии рибозима шпильки были разработаны, чтобы позволить более детальный экспериментальный анализ молекулы. [7] Это обычно используемая стратегия для отделения тех частей молекулы самопроцессорной РНК, которые необходимы для реакций процессинга РНК, от частей, которые выполняют несвязанные функции. Посредством этого процесса были идентифицированы минимальный каталитический домен из 50 нуклеотидов и субстрат из 14 нуклеотидов . [8] Используя эти искусственно полученные последовательности, транс-активный рибозим, который может катализировать расщепление множества молекул субстрата. Эта стратегия была важна тем, что позволяла исследователям (i) применять биохимические методы для ферментативного анализа, (ii) проводить эксперименты для определения основных структурных элементов комплекса рибозим-субстрат и (iii) разрабатывать сконструированные рибозимы, которые использовались в биомедицинских целях. приложения, включая предотвращение репликации патогенных вирусов и изучение функции отдельных генов.

Химия реакции [ править ]

Как и несколько других рибозимов и белковых рибонуклеаз, реакция расщепления шпилечного рибозима генерирует фрагменты РНК с концами, состоящими из 2 ', 3'-циклической фосфатной и 5'-гидроксильной группы. Реакция лигирования, по-видимому, представляет собой простое обращение расщепления, то есть ковалентное соединение фрагментов РНК, заканчивающихся 2 ', 3'-циклической фосфатной и 5'-гидроксильной группой, с образованием обычной 3'-5' фосфодиэфирной связи, используемой в обоих случаях. РНК и ДНК.

Исследования этой реакции в нескольких рибозимах помогли установить, что химия реакции (каталитический механизм) является эндогенным свойством самой молекулы РНК и не опосредуется ионами металлов, как это верно для некоторых белковых ферментов и некоторых других рибозимов. [9] Более того, активность расщепления все еще наблюдается, когда Mg 2+ заменяется на [Co (NH 3 ) 6 ] 3+ . [10] Co 3+ связывает NH 3 в растворе настолько прочно, что NH 3не диссоциирует в какой-либо заметной степени и, следовательно, не протонируется. Это говорит о том, что отсутствует катализируемый металлами перенос протона или прямая координация с РНК, но вместо этого металлы требуются только для фолдинга. Кроме того, в кристаллических структурах комплекса рибозим-ингибитор и имитатора переходного состояния было показано, что трехмерная архитектура разделяет A-1 и G + 1, позиционируя 2'-OH A-1 для in- линия нуклеофильной атаки на ножничную фосфатную связь. Кроме того, G8, A38 и A9, как предполагалось, играют роль в катализе, депротонируя 2'-OH в A-1, стабилизируя развивающийся отрицательный заряд пентакоординированных фосфатных атомов кислорода и протонируя уходящую 5'-O группу G + 1. [11] [12]

Структура [ править ]

Изображение трехмерной структуры рибозима шпильки. [13]

Минимальный комплекс шпильки рибозим-субстрат сворачивается во вторичную структуру, которая включает два домена, каждый из которых состоит из двух коротких спаренных спиралей, разделенных внутренней петлей. Домен A (спираль 1 - петля A - спираль 2) содержит субстрат и область распознавания первичного субстрата рибозима. Домен B (спираль 3 - петля B - спираль 4) больше по размеру и содержит первичные каталитические детерминанты рибозима. Два домена ковалентно соединены через фосфодиэфирную связь, которая соединяет спираль 2 со спиралью 3. Эти домены должны взаимодействовать друг с другом, чтобы произошел катализ. [14]

Когда минимальному комплексу рибозим-субстрат дают возможность свернуться в условиях низкой ионной силы , два домена складываются один поверх другого, образуя неактивную протяженную структуру, напоминающую шпильку. [15] Для катализа два домена лежат параллельно друг другу в складке, напоминающей скрепку. В различных публикациях эту РНК называют рибозимом «скрепка» или «шпилька». Несмотря на то, что первое название оказалось более точным, второе стало общепринятой номенклатурой. В лаборатории функциональному взаимодействию между двумя доменами способствует добавление катионов , положительный заряд которых достаточен для преодоленияэлектростатическое отталкивание отрицательно заряженного остова РНК. В природе ассоциации двух доменов способствует комбинация ионов металлов (включая Mg 2+ ) и присутствие двух дополнительных спиральных доменов, которые не присутствуют в минимальном комплексе рибозим-субстрат, но служат для обеспечения правильного трехмерного фолдинга. . Эти дополнительные домены укладываются на спирали 2 и 3, тем самым способствуя ассоциации двух функциональных доменов посредством так называемого четырехстороннего спирального соединения. [16]

Структура и активность рибозима шпильки были исследованы с использованием широкого ряда дополнительных экспериментальных методов, включая замену нуклеотидов, замену функциональных групп, комбинаторный отбор, флуоресцентную спектроскопию , ковалентное сшивание , анализ ЯМР и рентгеновскую кристаллографию . Этим исследованиям способствовала способность функционального комплекса к самосборке из сегментов, образованных твердофазным химическим синтезом РНК , что позволяет включать широкий спектр модифицированных нуклеотидов, которые в природе не встречаются в РНК. В совокупности результаты этих экспериментов представляют в высшей степени согласованную картину каталитического цикла., т.е. как шпилька рибозима связывает свой субстрат, складывается в определенную трехмерную структуру, катализирует реакцию и высвобождает продукт (ы) реакции. [17]

Целевое расщепление РНК и противовирусная активность [ править ]

Рибозимы-шпильки были модифицированы таким образом, что их можно использовать для нацеливания на расщепление других молекул РНК. Это возможно, потому что большая часть субстратной специфичности рибозима шпильки является результатом простого спаривания оснований Уотсона-Крика внутри спиралей 1 и 2. [18]

Особый интерес представляет разработка рибозимов-шпилек для потенциального терапевтического использования, например, для предотвращения репликации патогенных вирусов. Противовирусная шпилька рибозимы были получены и экспрессируется в клетках млекопитающих, и клетка , экспрессирующая различные инженерные рибозимо , как была показана , чтобы быть устойчивыми к инфекции ВИЧ-1 , [19] [20] гепатит В , [21] и вирус Синдбис . [22]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Симонс, RH (1997). «Патогенные РНК растений и катализ РНК» . Nucleic Acids Res . 25 (14): 2683–2689. DOI : 10.1093 / NAR / 25.14.2683 . PMC  146833 . PMID  9207012 .
  2. ^ Алам, S .; Грум-Токарс, В .; Krucinska, J .; Кундрачик, М .; Ведекинд, Дж. (2005). «Конформационная гетерогенность в положении U37 рибозима шпильки, полностью состоящей из РНК, с последствиями для связывания металлов и каталитической структуры S-поворота». Биохимия . 44 (44): 14396–14408. DOI : 10.1021 / bi051550i . PMID 16262240 . 
  3. ^ Feldstein, PA; Бузаян, JM; Брюнинг, Дж. (15 октября 1989 г.). «Две последовательности, участвующие в автолитическом процессинге комплементарной РНК сателлитного вируса кольцевой пятнистости табака». Джин . 82 (1): 53–61. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (89) 90029-2 . PMID 2583519 . 
  4. ^ Hampel, A; Триц, Р. (13 июня 1989 г.). «Каталитические свойства РНК минимальной (-) последовательности sTRSV». Биохимия . 28 (12): 4929–4933. DOI : 10.1021 / bi00438a002 . PMID 2765519 . 
  5. ^ Рубино, L; Tousignant, ME; Стегер, G; Капер, Дж. М. (сентябрь 1990 г.). «Нуклеотидная последовательность и структурный анализ двух сателлитных РНК, связанных с вирусом желтой крапинки цикория» . Журнал общей вирусологии . 71 (9): 1897–1903. DOI : 10.1099 / 0022-1317-71-9-1897 . PMID 1698918 . 
  6. ^ Капер, JM; Tousignant, ME; Steger, G (15 июля 1988 г.). «Нуклеотидная последовательность предсказывает округлость и саморасщепление 300-рибонуклеотидного сателлита вируса мозаики арабиса». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях . 154 (1): 318–325. DOI : 10.1016 / 0006-291x (88) 90687-0 . PMID 3395334 . 
  7. ^ Feldstein, PA; Брюнинг, Г. (1993). «Каталитически активная геометрия в обратимой циркуляризации« мини-мономерных »РНК, полученных из комплементарной цепи сателлитной РНК вируса кольцевой пятнистости табака» . Исследования нуклеиновых кислот . 21 (8): 1991–1998. DOI : 10.1093 / nar / 21.8.1991 . PMC 309442 . PMID 7684131 .  
  8. ^ Hampel, A; Триц, Р. (1989). «Каталитические свойства РНК минимальной (-) последовательности sTRSV». Биохимия . 28 (12): 4929–4933. DOI : 10.1021 / bi00438a002 . PMID 2765519 . 
  9. ^ Мюррей, JB; Сейхан, АА; Walter, NG; Берк, JM; Скотт, WG (1998). «Головка молотка, шпилька и рибозимы VS являются каталитически эффективными только с одновалентными катионами» (PDF) . Химия и биология . 5 (10): 587–595. DOI : 10.1016 / S1074-5521 (98) 90116-8 . PMID 9818150 .  
  10. ^ Янг, KJ; Gill, F .; Грасби, Дж. А. (1997-10-01). «Ионы металлов играют пассивную роль в реакции, катализируемой рибозимом шпильки» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (19): 3760–3766. DOI : 10.1093 / NAR / 25.19.3760 . ISSN 0305-1048 . PMC 146958 . PMID 9380495 .   
  11. ^ Руперт, ПБ; Ферре-Д'Амаре, АР (12 апреля 2001 г.). «Кристаллическая структура комплекса рибозим-ингибитор шпильки с последствиями для катализа». Природа . 410 (6830): 780–786. Bibcode : 2001Natur.410..780R . DOI : 10.1038 / 35071009 . ISSN 0028-0836 . PMID 11298439 .  
  12. ^ Руперт, Питер Б .; Massey, Archna P .; Сигурдссон, Снорри Тх; Ферре-Д'Амаре, Адриан Р. (15 ноября 2002 г.). «Стабилизация переходного состояния каталитической РНК» . Наука . 298 (5597): 1421–1424. Bibcode : 2002Sci ... 298.1421R . DOI : 10.1126 / science.1076093 . ISSN 1095-9203 . PMID 12376595 .  
  13. ^ Salter, J .; Krucinska, J .; Alam, S .; Грум-Токарс, В .; Ведекинд, JE (2006). «Вода в активном центре шпильчатого рибозима, полностью состоящего из РНК, и влияние вариантов основания Gua8 на геометрию переноса фосфорила» . Биохимия . 45 (3): 686–700. DOI : 10.1021 / bi051887k . PMC 2546605 . PMID 16411744 .  
  14. ^ Мясник, ЮВ; Хекман, Дж. Э .; Берк, JM (1995). «Восстановление активности рибозима шпильки после разделения функциональных доменов» . Журнал биологической химии . 270 (50): 29648–29651. DOI : 10.1074 / jbc.270.50.29648 . PMID 8530348 . 
  15. ^ Эстебан, JA; Walter, NG; Kotzorek, G .; Хекман, Дж. Э .; Берк, JM (1998). «Структурная основа гетерогенной кинетики: реинжиниринг шпильки рибозима» (PDF) . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (11): 6091–6096. Bibcode : 1998PNAS ... 95.6091E . DOI : 10.1073 / pnas.95.11.6091 . PMC 27590 . PMID 9600922 .   
  16. ^ Нахас, М .; Уилсон, Т.Дж.; Шляпа.; Лилли, DMJ (2005). «Сворачивание и катализ рибозима шпильки». Труды биохимического общества . 33 (Pt 3): 461–465. DOI : 10.1042 / BST0330461 . PMID 15916541 . 
  17. ^ Кокрейн, JC; Стробель, С.А. (2008). «Каталитические стратегии саморасщепляющихся рибозимов». Счета химических исследований . 41 (8): 1027–1035. DOI : 10.1021 / ar800050c . PMID 18652494 . 
  18. ^ Chowrira, BM; Берк, JM (1991). «Связывание и расщепление нуклеиновых кислот рибозимом« шпилька ». Биохимия . 30 (35): 8518–8522. DOI : 10.1021 / bi00099a003 . PMID 1909564 . 
  19. ^ Ю, М; Ojwang, J; Ямада, О; Hampel, A; Рапаппорт, Дж; Луни, Д; Вонг-Стаал, Ф (1993). «Рибозим шпильки подавляет экспрессию различных штаммов вируса иммунодефицита человека 1 типа» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 90 (13): 6340–6344. Bibcode : 1993PNAS ... 90.6340Y . DOI : 10.1073 / pnas.90.13.6340 . PMC 46924 . PMID 8327516 .  
  20. ^ Пуэрта-Фернандеса Е, Баррозо-дель Иисус А, Ромеро-López С, Н Тапиа, Мартинес М.А., Berzal-Herranz А (10 июня 2005). «Ингибирование репликации ВИЧ-1 с помощью РНК, направленной против области LTR» . СПИД . 19 (9): 863–870. DOI : 10.1097 / 01.aids.0000171399.77500.e0 . PMID 15905666 . 
  21. ^ Zu Putlitz, J .; Yu, Q .; Берк, JM; Жезлы, младший (1999). «Комбинаторный скрининг и внутриклеточная противовирусная активность шпилечных рибозимов, направленных против вируса гепатита B» . Журнал вирусологии . 73 (7): 5381–5387. DOI : 10,1128 / JVI.73.7.5381-5387.1999 . PMC 112594 . PMID 10364285 .  
  22. ^ Чжан, З .; Берк, Дж. (2005). «Ингибирование вирусной репликации рибозимом: мутационный анализ сайта и механизма противовирусной активности» . Журнал вирусологии . 79 (6): 3728–3736. DOI : 10,1128 / JVI.79.6.3728-3736.2005 . PMC 1075678 . PMID 15731266 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Доэрти, EA; Дудна Я.А. (2001). «Структуры и механизмы рибозима». Annu Rev Biophys Biomol Struct . 30 : 457–475. DOI : 10.1146 / annurev.biophys.30.1.457 . PMID  11441810 .
  • Ферре-Д'Амаре, АР; Руперт ПБ (2002). «Рибозим шпильки: от кристаллической структуры к функции» . Biochem Soc Trans . 30 (Pt 6): 1105–1109. DOI : 10.1042 / BST0301105 . PMID  12440983 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Страница для рибозима шпильки в Rfam