Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Репликация по вращающемуся кругу создает несколько копий одного круглого шаблона.

Подвижной круг репликации ( RCA ) представляет собой процесс однонаправленного нуклеиновой кислоты репликации , которые могут быстро синтезировать несколько копий кольцевых молекул ДНК или РНК , таких как плазмиды , в геномы из бактериофагов , и круговой РНК генома вироидов . Некоторые эукариотические вирусы также реплицируют свою ДНК или РНК по механизму катящегося круга.

В качестве упрощенной версии естественной репликации по катящемуся кругу был разработан метод изотермической амплификации ДНК, амплификация по катящемуся кругу. Механизм RCA широко используется в молекулярной биологии и биомедицинской нанотехнологии , особенно в области биосенсинга (как метод усиления сигнала). [1]

Циркулярная репликация ДНК [ править ]

Иллюстрация репликации катящегося круга.

Репликация ДНК по катящемуся кругу инициируется белком-инициатором, кодируемым плазмидной или ДНК бактериофага, который разрывает одну цепь двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в месте, называемом двухцепочечным ориджином, или DSO. Белок-инициатор остается связанным с 5'-фосфатным концом разорванной цепи, а свободный 3'-гидроксильный конец высвобождается, чтобы служить праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III.. Используя неотмеченную цепь в качестве матрицы, репликация происходит вокруг кольцевой молекулы ДНК, вытесняя разорванную цепь как одноцепочечную ДНК. Смещение разорванной цепи осуществляется кодируемой хозяином геликазой, называемой PcrA (сокращение от сокращенной копии плазмиды) в присутствии белка инициации репликации плазмиды.

Непрерывный синтез ДНК может производить несколько однонитевых линейных копий исходной ДНК в непрерывной последовательности, называемой конкатемером . Эти линейные копии могут быть преобразованы в двухцепочечные кольцевые молекулы с помощью следующего процесса:

Во-первых, белок-инициатор делает еще один разрыв в ДНК, чтобы остановить синтез первой (ведущей) цепи. РНК-полимераза и ДНК-полимераза III затем реплицируют одноцепочечную исходную ДНК (SSO), образуя еще один двухцепочечный круг. ДНК-полимераза I удаляет праймер, заменяя его ДНК, а ДНК-лигаза соединяет концы, образуя еще одну молекулу двухцепочечной кольцевой ДНК.

Итак, типичная репликация катящегося круга ДНК состоит из пяти этапов: [2]

  1. Круговая дцДНК будет «разорвана».
  2. 3' - конец удлиняется с помощью „unnicked“ ДНК в качестве ведущей цепи (шаблон); 5 'конец смещен.
  3. Вытесненная ДНК представляет собой отстающую нить и сделана двухцепочечной через ряд фрагментов Окадзаки .
  4. Репликация как «незарегистрированной», так и смещенной оцДНК.
  5. Смещенная ДНК циркулирует.

Вирусология [ править ]

Репликация вирусной ДНК [ править ]

Некоторые ДНК-вирусы реплицируют свою геномную информацию в клетках-хозяевах посредством репликации по катящемуся кругу. Например, человеческий герпесвирус-6 (HHV-6) (hibv) экспрессирует набор «ранних генов», которые, как считается, вовлечены в этот процесс. [3] Образующиеся длинные конкатемеры впоследствии расщепляются между участками pac-1 и pac-2 генома HHV-6 с помощью рибозимов, когда они упаковываются в отдельные вирионы. [4]

Модель для репликации катящегося круга HPV16.

Вирус папилломы человека-16 (ВПЧ-16) - еще один вирус, который использует скользящую репликацию для получения потомства с высокой скоростью. ВПЧ-16 инфицирует эпителиальные клетки человека и имеет двухцепочечный кольцевой геном. Во время репликации в ориджине гексамер E1 оборачивается вокруг однонитевой ДНК и перемещается в направлении от 3 'до 5'. При нормальной двунаправленной репликации два репликационных белка диссоциируют во время столкновения, но в HPV-16 считается, что гексамер E1 не диссоциирует, что приводит к непрерывной катящейся репликации. Считается, что этот механизм репликации ВПЧ может иметь физиологические последствия для интеграции вируса в хромосому хозяина и возможного развития рака шейки матки. [5]

Кроме того, геминивирустакже использует репликацию катящегося круга в качестве механизма репликации. Это вирус, ответственный за уничтожение многих основных сельскохозяйственных культур, таких как маниока, хлопок, бобовые, кукуруза, томаты и окра. Вирус имеет кольцевую одноцепочечную ДНК, которая реплицируется в клетках растения-хозяина. Весь процесс инициируется геминивирусным белком инициатора репликации Rep, который также отвечает за изменение среды хозяина, чтобы действовать как часть механизма репликации. Rep также поразительно похож на большинство других белков инициаторов катящейся репликации эубактерий, с наличием мотивов I, II и III на N-конце. Во время репликации по методу катящегося круга оцДНК геминивируса преобразуется в дцДНК, и Rep затем присоединяется к дцДНК в исходной последовательности TAATATTAC. После Rep, наряду с другими белками репликации,связывается с дцДНК, он образует петлю ствола, в которой ДНК затем расщепляется по наномерной последовательности, вызывая смещение цепи. Это смещение позволяет репликационной вилке продвигаться в направлении от 3 'до 5', что в конечном итоге дает новую цепь оцДНК и конкатамерную цепь ДНК.[6]

Промежуточные продукты репликации ДНК бактериофага Т4 включают кольцевые и разветвленные кольцевые конкатемерные структуры. [7] Эти структуры, вероятно, отражают механизм репликации катящегося круга.

Репликация вирусной РНК [ править ]

Некоторые РНК-вирусы и вироиды также реплицируют свой геном посредством репликации РНК по кругу. Для вироидов существует два альтернативных пути репликации РНК, за которыми, соответственно, следуют члены семейства Pospivirodae (асимметричная репликация) и Avsunviroidae (симметричная репликация).

Репликация по катящемуся кругу вирусной РНК

В семействе Pospiviroidae (PSTVd-like) кольцевая плюс-цепь РНК транскрибируется с помощью РНК-полимеразы хозяина в олигомерные минус-цепи, а затем олигомерные плюс-цепи. [8] Эти олигомерные плюс-цепи расщепляются РНКазой хозяина и лигируются РНК-лигазой хозяина для преобразования мономерной плюс-цепи кольцевой РНК. Это называется асимметричным путем репликации по катящемуся кругу. Вироиды семейства Avsunviroidae (ASBVd-подобные) реплицируют свой геном посредством симметричного пути репликации по катящемуся кругу. [9]В этом симметричном пути олигомерные минус-цепи сначала расщепляются и лигируются с образованием мономерных минус-цепей, а затем транскрибируются в олигомерные плюс-цепи. Эти олигомерные плюс-цепи затем отщепляются и лигируются для преобразования мономерной плюс-цепи. Симметричный путь репликации был назван потому, что как положительные, так и отрицательные цепи образуются одинаково.

Расщепление олигомерных плюсовых и минусовых цепей опосредуется саморасщепляющейся структурой рибозима в форме головки молотка, присутствующей у Avsunviroidae, но такая структура отсутствует у Pospiviroidae. [10]

Усиление катящегося круга [ править ]

Молекулярный механизм усиления катящегося круга (RCA)

Производная форма репликации по катящемуся кругу успешно использовалась для амплификации ДНК из очень небольших количеств исходного материала. [1] Этот метод усиления называется усилением по скользящему кругу (RCA). В отличие от традиционных методов амплификации ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) , RCA - это метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, при котором полимераза непрерывно добавляет отдельные нуклеотиды к праймеру, отожженному к круговой матрице, что приводит к длинной конкатемерной оцДНК, содержащей от десятков до сотен тандемных повторов (дополняющих круговой шаблон). [11]

Для проведения реакции RCA необходимы пять важных компонентов:

  1. ДНК-полимераза
  2. Подходящий буфер, совместимый с полимеразой.
  3. Короткий праймер для ДНК или РНК
  4. Круглый шаблон ДНК
  5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ)
Методы обнаружения продукта RCA

Полимеразы, используемые в RCA, - это экзо- ДНК-полимераза Phi29 , Bst и Vent для амплификации ДНК и РНК-полимераза T7 для амплификации РНК. Поскольку ДНК-полимераза Phi29 имеет лучшую процессивность и способность к вытеснению цепи среди всех вышеупомянутых полимераз, она наиболее часто использовалась в реакциях RCA. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), RCA можно проводить при постоянной температуре (от комнатной температуры до 65 ° C) как в свободном растворе, так и на иммобилизованных мишенях (твердофазная амплификация).

Обычно реакция RCA ДНК включает три этапа:

  1. Циркулярное лигирование матрицы, которое можно проводить посредством ферментативного лигирования, опосредованного матрицей (например, ДНК-лигаза Т4) или лигирования без матрицы с использованием специальных ДНК-лигаз (например, CircLigase).
  2. Праймер- индуцированное удлинение одноцепочечной ДНК. Для гибридизации с одним кругом можно использовать несколько праймеров. В результате может быть инициировано несколько событий амплификации, в результате чего будет получено несколько продуктов RCA («Multiprimed RCA»).
  3. Обнаружение и визуализация продуктов амплификации, которые чаще всего проводятся с помощью флуоресцентного обнаружения, с помощью флуорофор-конъюгированного dNTP, связанных с флуорофором комплементарных или флуоресцентно меченных молекулярных маяков . В дополнение к флуоресцентным подходам, гель-электрофорез также широко используется для обнаружения продукта RCA.

RCA производит линейную амплификацию ДНК, поскольку каждая круговая матрица растет с заданной скоростью в течение определенного периода времени. Для увеличения выхода и достижения экспоненциальной амплификации, как это делает ПЦР, было исследовано несколько подходов. Одним из них является амплификация с гиперразветвленным катящимся кругом или HRCA, когда добавляются и удлиняются праймеры, которые отжигаются с исходными продуктами RCA. [12] Таким образом, исходный RCA создает больше шаблонов, которые можно усилить. Другой - круговая амплификация или C2CA, где продукты RCA перевариваются рестрикционным ферментом и лигируются в новые кольцевые матрицы с использованием рестрикционного олигонуклеотида, за которым следует новый цикл RCA с большим количеством кольцевых матриц для амплификации. [13]

Приложения RCA [ править ]

иллюстрация иммуно-RCA

RCA может усилить единичное событие молекулярного связывания более чем в тысячу раз, что делает его особенно полезным для обнаружения мишеней со сверхнизким содержанием. Реакции RCA могут проводиться не только в среде свободного раствора, но и на твердой поверхности, такой как стекло, микрошарики или наночастицы, микропланшеты, микрофлюидные устройства или даже бумажные полоски. Эта особенность делает его очень мощным инструментом для усиления сигналов в твердофазных иммуноанализах (например, ELISA ). Таким образом, RCA становится универсальным инструментом для усиления сигнала с широким спектром приложений в геномике, протеомике, диагностике и биодатчиках.

Иммуно-RCA [ править ]

Immuno-RCA - это метод изотермического усиления сигнала для высокоспецифичного и высокочувствительного обнаружения и количественного определения белков. Этот метод сочетает в себе две области: RCA, позволяющую амплификацию нуклеотидов, и иммуноанализ, в котором используются антитела, специфичные к внутриклеточным или свободным биомаркерам. В результате иммуно-RCA дает специфический усиленный сигнал (высокое отношение сигнал / шум), что делает его пригодным для обнаружения, количественной оценки и визуализации протеиновых маркеров с низким содержанием в жидкофазных иммуноанализах [14] [15] и иммуногистохимии .

Иммуно-RCA следует типичной иммуноабсорбирующей реакции в ELISA или иммуногистохимическом окрашивании тканей. [16] Детектирующие антитела, используемые в реакции иммуно-RCA, модифицируются путем присоединения олигонуклеотида оцДНК к концу тяжелых цепей. Таким образом, участок Fab (фрагмент, связывание антигена) детектирующего антитела все еще может связываться со специфическими антигенами, а олигонуклеотид может служить праймером для реакции RCA.

Типичная процедура иммуно-RCA, опосредованная антителами, выглядит следующим образом:

Иллюстрация иммуно-rca на основе аптамера

1. Детектирующее антитело распознает конкретную белковую мишень. Это антитело также прикреплено к олигонуклеотидному праймеру.

2. Когда присутствует кольцевая ДНК, она отжигается, и праймер совпадает с комплементарной последовательностью кольцевой ДНК.

3. Комплементарная последовательность кольцевой ДНК-матрицы копируется сотни раз и остается прикрепленной к антителу.

4. Выход RCA (удлиненная оцДНК) обнаруживается с помощью флуоресцентных зондов с использованием флуоресцентного микроскопа или считывающего устройства для микропланшетов.

Иммуно-RCA на основе аптамеров [17] [ править ]

В дополнение к опосредованной антителами иммуно-RCA праймер оцДНК RCA также может быть конъюгирован с 3'-концом ДНК-аптамера. Хвост праймера можно амплифицировать с помощью амплификации по катящемуся кругу. Продукт можно визуализировать по маркировке флуоресцентного репортера. [18] Процесс показан на рисунке справа.

Другие приложения RCA [ править ]

Различные производные RCA широко использовались в области биосенсинга. Например, RCA успешно использовался для обнаружения наличия вирусной и бактериальной ДНК в клинических образцах [19] [20], что очень полезно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний . Он также использовался в качестве метода усиления сигнала на чипе для анализа микрочипов нуклеиновых кислот (как для ДНК, так и для РНК) . [1]

В дополнение к функции амплификации в приложениях биочувствительности, метод RCA также может применяться для создания наноструктур ДНК и гидрогелей ДНК . Продукты RCA также могут быть использованы в качестве темплатов для периодической сборки наноразмеров или белков, синтеза металлических нанопроволок [21] и формирования наноостровков . [1]

См. Также [ править ]

  • Селектор-техника

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б в г Али, М. Монсур; Ли, Фэн; Чжан, Чжицин; Чжан, Кайсян; Канг, Донг-Ку; Анкрум, Джеймс А .; Ле, X. Крис; Чжао, Вэйан (2014). «Усиление катящегося круга: универсальный инструмент для химической биологии, материаловедения и медицины». Обзоры химического общества . 43 (10): 3324–41. DOI : 10.1039 / C3CS60439J . PMID  24643375 .
  2. ^ Усиление вращающегося круга (RCA) - к новой клинической практике | Вадим Васильевич Демидов | Springer . Springer. 2016. ISBN. 9783319422244.
  3. ^ Арбакл, Джесси (2011). «Молекулярная биология латентного периода вируса герпеса-6 человека и интеграции теломер» . Микробы и инфекции . 13 (8–9): 731–741. DOI : 10.1016 / j.micinf.2011.03.006 . PMC 3130849 . PMID 21458587 .  
  4. ^ Боренштейн, Ронен; Френкель, Низа (2009). «Клонирование генома вируса герпеса человека 6A в бактериальные искусственные хромосомы и исследование промежуточных продуктов репликации ДНК» . Труды Национальной академии наук . 106 (45): 19138–19143. Bibcode : 2009PNAS..10619138B . DOI : 10.1073 / pnas.0908504106 . PMC 2767366 . PMID 19858479 .  
  5. ^ Кусумото-Мацуо, Rika; Канда, Тадахито; Кукимото, Ивао (01.01.2011). «Репликация катящегося круга ДНК вируса папилломы человека типа 16 в экстрактах эпителиальных клеток». Гены в клетки . 16 (1): 23–33. DOI : 10.1111 / j.1365-2443.2010.01458.x . ISSN 1365-2443 . PMID 21059156 .  
  6. ^ Ризви, Ирам; Чоудхури, Нирупам Рой; Тутея, Нарендра (01.02.2015). «Понимание функциональных характеристик белка инициатора репликации катящегося круга геминивируса и его взаимодействия с факторами хозяина, влияющими на репликацию вирусной ДНК». Архив вирусологии . 160 (2): 375–387. DOI : 10.1007 / s00705-014-2297-7 . ISSN 0304-8608 . PMID 25449306 .  
  7. Перейти ↑ Bernstein H, Bernstein C (июль 1973). «Круглые и разветвленные кольцевые конкатенации в качестве возможных промежуточных продуктов в репликации ДНК бактериофага Т4». J. Mol. Биол . 77 (3): 355–61. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (73) 90443-9 . PMID 4580243 . 
  8. ^ Дарос, Хосе-Антонио; Елена, Сантьяго Ф .; Флорес, Рикардо (июнь 2006 г.). «Вироиды: нить Ариадны в лабиринте РНК» . EMBO Reports . 7 (6): 593–598. DOI : 10.1038 / sj.embor.7400706 . ISSN 1469-221X . PMC 1479586 . PMID 16741503 .   
  9. ^ Tsagris, Efthimia Mina; Мартинес де Альба, Анхель Эмилио; Гозманова, Марьяна; Калантидис, Критон (01.11.2008). «Вироиды» . Клеточная микробиология . 10 (11): 2168–2179. DOI : 10.1111 / j.1462-5822.2008.01231.x . ISSN 1462-5822 . PMID 18764915 .  
  10. ^ Флорес, Рикардо; Газ, Мария-Евгения; Молина-Серрано, Диего; Ноалес, Мария-Анхелес; Карбонелл, Альберто; Гаго, Сельма; Де ла Пенья, Маркос; Дарос, Хосе-Антонио (14 сентября 2009 г.). «Репликация вироидов: катящиеся круги, ферменты и рибозимы» . Вирусы . 1 (2): 317–334. DOI : 10,3390 / v1020317 . PMC 3185496 . PMID 21994552 .  
  11. ^ Али, М. Монсур; Ли, Фэн; Чжан, Чжицин; Чжан, Кайсян; Канг, Донг-Ку; Анкрум, Джеймс А .; Ле, X. Крис; Чжао, Вэйан (21.05.2014). «Усиление катящегося круга: универсальный инструмент для химической биологии, материаловедения и медицины». Обзоры химического общества . 43 (10): 3324–3341. DOI : 10.1039 / c3cs60439j . ISSN 1460-4744 . PMID 24643375 .  
  12. ^ Лизарди, Пол М .; Хуан, Сяохуа; Чжу, Чжэнжун; Брей-Уорд, Патрисия; Томас, Дэвид С .; Уорд, Дэвид С. (июль 1998 г.). «Обнаружение мутаций и подсчет одиночных молекул с использованием изотермической амплификации по катящемуся кругу» . Генетика природы . 19 (3): 225–232. DOI : 10,1038 / 898 . ISSN 1546-1718 . 
  13. ^ Dahl, Фредрик; Банер, Йохан; Гуллберг, Матс; Мендель-Хартвиг, Марита; Ландегрен, Ульф; Нильссон, Матс (30 марта 2004 г.). «Круг усиление к окружности для точного и чувствительного анализа ДНК» . Труды Национальной академии наук . 101 (13): 4548-4553. DOI : 10.1073 / pnas.0400834101 . ISSN 0027-8424 . PMID 15070755 .  
  14. ^ Швейцер, Барри; Робертс, Скотт; Гримуэйд, Брайан; Шао, Вэйпин; Ван, Миньцзюань; Фу, Цинь; Шу, Quiping; Ларош, Изабель; Чжоу, Чжимин (апрель 2002 г.). «Профилирование мультиплексных белков на микрочипах путем амплификации по типу катящегося круга» . Природа Биотехнологии . 20 (4): 359–365. DOI : 10.1038 / nbt0402-359 . ISSN 1087-0156 . PMC 2858761 . PMID 11923841 .   
  15. ^ Чжоу, Лонг; Оу, Ли-Хуан; Чу, Ся; Шен, Го-Ли; Ю, Жу-Цинь (2007). "Амплификация по вращающемуся кругу на основе аптамеров: платформа для электрохимического обнаружения белка". Аналитическая химия . 79 (19): 7492–7500. DOI : 10.1021 / ac071059s . PMID 17722881 . 
  16. ^ Гусев, Ю .; Sparkowski, J .; Рагхунатан, А .; Ferguson, H .; Montano, J .; Богдан, Н .; Schweitzer, B .; Wiltshire, S .; Кингсмор, Сан-Франциско (июль 2001 г.). «Амплификация по вращающемуся кругу: новый подход к повышению чувствительности для иммуногистохимии и проточной цитометрии» . Американский журнал патологии . 159 (1): 63–69. DOI : 10.1016 / S0002-9440 (10) 61674-4 . ISSN 0002-9440 . PMC 1850404 . PMID 11438455 .   
  17. ^ Чжао, Вэйан; Али, М. Монсур; Брук, Майкл А .; Ли, Инфу (11 августа 2008 г.). «Усиление вращающегося круга: приложения в нанотехнологиях и биодетекции с функциональными нуклеиновыми кислотами». Angewandte Chemie International Edition . 47 (34): 6330–6337. DOI : 10.1002 / anie.200705982 . ISSN 1521-3773 . PMID 18680110 .  
  18. ^ Чжоу, Лонг; Оу, Ли-Хуан; Чу, Ся; Шен, Го-Ли; Ю, Жу-Цинь (01.10.2007). "Амплификация по вращающемуся кругу на основе аптамеров: платформа для электрохимического обнаружения белка". Аналитическая химия . 79 (19): 7492–7500. DOI : 10.1021 / ac071059s . ISSN 0003-2700 . PMID 17722881 .  
  19. ^ Чэнь, Сяоюй; Ван, Бин; Ян, Вэнь; Конг, Фанронг; Ли, Чуанью; Сунь, Чжаоган; Джелфс, Питер; Гилберт, Гвендолин Л. (2014-05-01). «Амплификация по кругу для прямого обнаружения мутаций гена rpoB в изолятах Mycobacterium tuberculosis из клинических образцов» . Журнал клинической микробиологии . 52 (5): 1540–1548. DOI : 10.1128 / JCM.00065-14 . ISSN 0095-1137 . PMC 3993705 . PMID 24574296 .   
  20. ^ Лю, Ян; Го, Янь-Линь; Цзян, Гуан-Лу; Чжоу, Ши-Цзе; Солнце, Ци; Чен, Си; Чанг, Сю-Цзюнь; Син, Ай-Инь; Ду Фэн-Цзяо (04.06.2013). «Применение гиперразветвленной амплификации катящегося круга для прямого обнаружения Mycobacterium Tuberculosis в клинических образцах мокроты» . PLOS One . 8 (6): e64583. Bibcode : 2013PLoSO ... 864583L . DOI : 10.1371 / journal.pone.0064583 . ISSN 1932-6203 . PMC 3672175 . PMID 23750210 .   
  21. ^ Го, Маосян; Эрнандес-Нойта, Иван; Мадабуси, Нараянан; Нильссон, Матс; Вейнгаарт, Воутер ван дер (12 февраля 2018 г.). «Эффективный ДНК-ассистированный синтез трансмембранных золотых нанопроволок» . Микросистемы и нанотехнология . 4 : 17084. DOI : 10.1038 / micronano.2017.84 . ISSN 2055-7434 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Системы репликации ДНК, используемые с небольшими кольцевыми молекулами ДНК Genomes 2 , T. Brown et al., В NCBI Books
  • MicrobiologyBytes: Вироиды и вирусоиды
  • http://mcmanuslab.ucsf.edu/node/246