Фрагмент Кленова является большой белок , фрагмент получают , когда ДНК - полимеразы I из E.coli , является ферментативно расщепляется протеазы субтилизина . Впервые описанный в 1970 году [1], он сохраняет 5 '→ 3' полимеразную активность и 3 '→ 5' экзонуклеазную активность для удаления прекодирующих нуклеотидов и проверки, но теряет свою 5 '→ 3' экзонуклеазную активность.
Другой меньший фрагмент, образующийся при расщеплении ДНК-полимеразы I из E. coli субтилизином, сохраняет активность экзонуклеазы 5 '→ 3', но не обладает двумя другими активностями, проявляемыми фрагментом Кленова (т.е. 5 '→ 3' полимеразной активностью и 3 '→ 5' экзонуклеазная активность).
Исследование [ править ]
Поскольку 5 '→ 3' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из E. coli делает ее непригодной для многих приложений, фрагмент Кленова, в котором отсутствует эта активность, может быть очень полезным в исследованиях. Фрагмент Кленова чрезвычайно полезен для исследовательских задач, таких как:
- Синтез двухцепочечной ДНК из одноцепочечных матриц
- Заполнение отступивших 3-дюймовых концов фрагментов ДНК, чтобы сделать 5-футовый выступ тупым
- Переваривание выступающих 3-футовых выступов
- Приготовление радиоактивных ДНК-зондов
Фрагмент Кленова также был исходным ферментом, который использовался для значительного усиления сегментов ДНК в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2] до того, как был заменен термостабильными ферментами, такими как полимераза Taq . [3]
Фрагмент экзо- Кленова [ править ]
Так же, как 5 '→ 3' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из E.coli может быть нежелательной, экзонуклеазная активность 3 '→ 5' фрагмента Кленова также может быть нежелательной для определенных применений. Эту проблему можно преодолеть, внося мутации в ген, кодирующий Кленова. Это приводит к экспрессии форм фермента, которые сохраняют 5 '→ 3' полимеразную активность, но лишены какой-либо экзонуклеазной активности (5 '→ 3' или 3 '→ 5'). Эта форма фермента называется экзокленовским фрагментом .
Фрагмент экзо-Кленова используется в некоторых реакциях флуоресцентного мечения для микрочипов, а также в хвостах dA и dT, важном этапе процесса лигирования адаптеров ДНК к фрагментам ДНК, часто используемых при подготовке библиотек ДНК для секвенирования Next-Gen. (например, см. [1] )
Ссылки [ править ]
- ^ Кленова H и Henningsen I (1970). «Селективное устранение экзонуклеазной активности полимеразы дезоксирибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli B путем ограниченного протеолиза» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 65 (1): 168–175. DOI : 10.1073 / pnas.65.1.168 . PMC 286206 . PMID 4905667 .
- ^ Сайки РК и др. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 : 1350–54. DOI : 10.1126 / science.2999980 . PMID 2999980 .
- ^ Сайки; и другие. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой». Наука . 239 : 487–91. DOI : 10.1126 / science.239.4839.487 . PMID 2448875 .
Внешние ссылки [ править ]
- Klenow + Фрагмент в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- Схема на vivo.colostate.edu
