Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Количественная оценка без метки - это метод масс-спектрометрии , целью которого является определение относительного количества белков в двух или более биологических образцах. В отличие от других методов количественного определения белка, количественный анализ без метки не использует стабильные изотопные соединения для химического связывания с белком и, таким образом, метки. [1] [2]

Реализация [ править ]

Эксперимент по количественной оценке без этикеток с 3 образцами, 3 файлами ЖХ-МС и 5 ионами / пептидами-предшественниками. В этом конкретном случае для количественного определения используются значения интенсивности на пике хроматографических пиков. Пептиды идентифицируются с помощью масс-спектров фрагментации, и некоторые из ионов-предшественников будут определены количественно, но не сопоставлены ни с какой пептидной последовательностью.

Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала-предшественника или на спектральном подсчете . Первый метод полезен , когда применяется к масс - спектров с высокой точностью, например, полученные с использованием нового поколения времени пролета (TOF), преобразование Фурье ионного циклотронного резонанса (FTICR), или Orbitrap масс - анализаторов. Мощность высокого разрешения облегчает выделение пептидных сигналов на уровне MS 1 и, таким образом, отделяет количественную оценку от процесса идентификации. Напротив, спектральный подсчет просто подсчитывает количество спектров, идентифицированных для данного пептида в различных биологических образцах, а затем объединяет результаты для всех измеренных пептидов белка (белков), которые оцениваются количественно.

Вычислительная структура подхода без меток включает в себя обнаружение пептидов, сопоставление соответствующих пептидов по множеству данных ЖХ-МС, выбор дискриминационных пептидов. [3] [4]

Спектрометрия экспрессии интактного белка (IPEx) - это метод количественной оценки без использования этикеток в масс-спектрометрии, разрабатываемый группой аналитической химии в Центре безопасности пищевых продуктов и прикладного питания Управления по контролю за продуктами и лекарствами США и в других местах. Интактные белки анализируются с помощью прибора LCMS , обычно квадрупольного времени пролета в режиме профиля, и полный профиль белка определяется и количественно оценивается с использованием программного обеспечения для обработки данных.Первые результаты очень обнадеживают. В одном исследовании две группы повторений лечения из образцов млекопитающих (разные организмы с аналогичной историей лечения, но не технические повторения) показывают десятки биомаркеров белка с низким CV, что позволяет предположить, что IPEx является жизнеспособной технологией для изучения экспрессии белка. [5]

Обнаружение пептидов [ править ]

Обычно пептидные сигналы обнаруживаются на уровне MS1 и отличаются от химического шума по их характерной изотопной структуре. Затем эти закономерности отслеживаются по измерению времени удерживания и используются для восстановления хроматографического профиля элюирования массы моноизотопного пептида. Полный ионный ток пептидного сигнала затем интегрируется и используется в качестве количественного измерения исходной концентрации пептида. Для каждого детектированного пептида сначала обнаруживаются все изотопные пики, а затем определяется состояние заряда.

Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала предшественника и имеет проблемы из-за помех изоляции: в высокопроизводительных исследованиях идентичность измеряемого иона-предшественника пептида легко может быть совершенно другим пептидом с аналогичным соотношением m / z и который элюируется в период времени, совпадающий с временным интервалом первого пептида. Спектральный подсчет имеет проблемы из-за того, что пептиды идентифицируются, что делает необходимым выполнение дополнительного сканирования MS / MS, которое требует времени и, следовательно, снижает разрешающую способность эксперимента.

Соответствующие пептиды [ править ]

В отличие от дифференциальной маркировки, каждый биологический образец необходимо измерять отдельно в эксперименте без маркировки. Затем извлеченные пептидные сигналы отображаются в нескольких или нескольких измерениях ЖХ-МС с использованием их координат по измерениям массы-заряда и времени удерживания. Данные, полученные с помощью высокоточных приборов, значительно облегчают этот процесс и повышают уверенность в сопоставлении правильных пептидных сигналов во время анализа.

Очевидно, что дифференциальная обработка биологических образцов требует наличия стандарта, который можно использовать для корректировки результатов. Для этой цели можно использовать пептиды, уровень экспрессии которых не ожидается в различных биологических образцах. Однако не все пептиды хорошо ионизируются, и поэтому выбор кандидатов следует делать после первоначального исследования, которое должно охарактеризовать только содержание белка в биологических образцах, которые будут исследованы.

Выбор дискриминационных пептидов [ править ]

Наконец, сложные методы нормализации используются для удаления систематических артефактов в значениях интенсивности пептидов между измерениями ЖХ-МС. Затем идентифицируют дискриминирующие пептиды путем выбора пептидов, нормализованная интенсивность которых различна (например, значение p <0,05) среди нескольких групп образцов.

Кроме того, более новые гибридные масс-спектрометры, такие как LTQ OrbiTrap, предлагают возможность получения идентификации пептидов MS / MS параллельно с измерением пептидов с высокой точностью масс на уровне MS1. Это создает вычислительную проблему для обработки и интеграции этих двух источников информации и привело к разработке новых многообещающих стратегий количественной оценки.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Кюстер B (октябрь 2007). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: критический обзор» . Аналитическая и биоаналитическая химия . 389 (4): 1017–31. DOI : 10.1007 / s00216-007-1486-6 . PMID  17668192 .
  2. ^ Asara JM, Christofk HR, Freimark LM, LC Cantley (март 2008). «Метод количественной оценки без меток с помощью MS / MS TIC по сравнению с SILAC и спектральным подсчетом на протеомном экране» . Протеомика . 8 (5): 994–9. DOI : 10.1002 / pmic.200700426 . PMID 18324724 . 
  3. ^ Мосты С.М., Маги ГБ, Ван N, Williams РГ, Берджесс СК, Nanduri В (2007). «ProtQuant: инструмент для количественной оценки данных протеомики MudPIT без меток» . BMC Bioinformatics . 8 Приложение 7: S24. DOI : 10.1186 / 1471-2105-8-S7-S24 . PMC 2099493 . PMID 18047724 .  
  4. ↑ Лукас Н. Мюллер; и другие. (2008). «Оценка программных решений для анализа данных количественной протеомики на основе масс-спектрометрии». Журнал протеомных исследований . 7 (1): 51–61. CiteSeerX 10.1.1.336.4416 . DOI : 10.1021 / pr700758r . PMID 18173218 .  
  5. ^ Шолль, П.Ф., Стратегия ЖХ / МС интактного белка для разработки биомаркеров сыворотки: биомаркеры реакции печени на химиопрофилактическое лечение тритерпеноидом CDDO-Im , Аннотация , TOA 8:35 утра Конференция ASMS, 2007.