Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Семейство бактериальных люциферазных монооксигеназ
Идентификаторы
СимволBac_luciferase
PfamPF00296
ИнтерПроIPR016048
PROSITEPDOC00397
SCOP21nfp / SCOPe / SUPFAM
Доступные белковые структуры:
Pfam  структуры / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumрезюме структуры
PDB1brl , 1bsl , 1ezw , 1fvp , 1luc , 1m41 , 1nfp , 1nqk , 1rhc , 1xkj
Каталитический домен динофлагеллят люциферазы
PDB 1vpr EBI.jpg
кристаллическая структура люциферазного домена динофлагелляты Lingulodinium polyedrum
Идентификаторы
СимволЛюцифераза_ кошка
PfamPF10285
ИнтерПроIPR018804
Доступные белковые структуры:
Pfam  структуры / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumрезюме структуры
N-концевой домен динофлагеллат люциферазы / LBP
Идентификаторы
СимволЛюцифераза_N
PfamPF05295
ИнтерПроIPR007959
Доступные белковые структуры:
Pfam  структуры / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumрезюме структуры
Домен спирального пучка динофлагеллат люциферазы
Идентификаторы
СимволЛюцифераза_3H
PfamPF10284
ИнтерПроIPR018475
Доступные белковые структуры:
Pfam  структуры / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumрезюме структуры

Люцифераза - это общий термин для класса окислительных ферментов , производящих биолюминесценцию , и обычно отличается от фотобелка . Название было впервые использовано Рафаэлем Дюбуа, который изобрел слова люциферин и люцифераза для обозначения субстрата и фермента соответственно. Оба слова произошли от латинского lucifer, что означает светоносец .

Люцифераза светлячка
Структура люциферазы светлячков Photinus pyralis .
Идентификаторы
ОрганизмPhotinus pyralis
СимволЛюцифераза светлячка
PDB1LCI Больше структур
UniProtP08659
Прочие данные
Номер ЕС1.13.12.7
Ищи
СтруктурыШвейцарская модель
ДоменыИнтерПро

Люциферазы широко используются в биотехнологии , для микроскопии и в качестве репортерных генов для многих из тех же приложений, что и флуоресцентные белки . Однако, в отличие от флуоресцентных белков, люциферазы не требуют внешнего источника света , но требуют добавления люциферина , потребляемого субстрата.

Примеры [ править ]

Множество организмов регулируют свое световое производство с помощью различных люцифераз в различных светоизлучающих реакциях. Большинство изученных люцифераз было обнаружено у животных, включая светлячков , и многих морских животных, таких как веслоногие рачки , медузы и морские анютины глазки . Однако люциферазы изучались на светящихся грибах, таких как гриб Джек-О-Фонарь , а также на примерах из других царств, включая светящиеся бактерии и динофлагеллаты .

Светлячок и жук-щелкун [ править ]

В люциферазах светлячков - которых насчитывается более 2000 видов - и других элатероидного (щелкуны и родственники в целом) разнообразно достаточно , чтобы быть полезными в молекулярной филогении . [1] У светлячков необходимый кислород поступает через трубку в брюшной полости, называемую брюшной трахеей . Одна хорошо изученная люцифераза - это люцифераза светлячка Photinini Photinus pyralis , оптимальная pH которой составляет 7,8. [2]

Морские анютины глазки [ править ]

Также хорошо изученным является морская фиалка , Renilla reniformis . В этом организме люцифераза ( ренилла-люциферин-2-монооксигеназа ) тесно связана с люциферин-связывающим белком, а также с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ). Триггера кальция релиз люциферина ( Коэлентеразин ) от связывающего белка люциферина. Затем субстрат доступен для окисления люциферазой, где он разлагается до целентерамида с выделением энергии. В отсутствие GFP эта энергия выделялась бы в виде фотона синего света (максимальная длина волны излучения 482 нм). Однако из-за тесно связанного GFP энергия, выделяемая люциферазой, вместо этого передается черезрезонансная энергия передается на флуорофор GFP и впоследствии высвобождается в виде фотона зеленого света (пиковая длина волны излучения 510 нм). Катализируемая реакция: [3]

  • коелентеразин + O 2 → целентерамид + CO 2 + фотон света

Copepod [ править ]

Недавно были обнаружены новые люциферазы, которые, в отличие от других люцифераз, представляют собой молекулы, секретируемые естественным путем. Одним из таких примеров являются Metridia коэлентеразина -зависимой люциферазой (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) , который является производной от морского копепода Metridia Лонга . Ген люциферазы, секретируемый Metridia longa , кодирует белок 24 кДа, содержащий N-концевой секреторный сигнальный пептид из 17 аминокислотных остатков. Чувствительность и высокая интенсивность сигнала этой молекулы люциферазы оказались полезными во многих репортерных исследованиях. Некоторыми из преимуществ использования секретируемой репортерной молекулы, такой как MetLuc, является протокол без лизиса, который позволяет проводить анализы живых клеток и множественные анализы на одной и той же клетке. [4]

Бактериальный [ править ]

Биолюминесценция бактерий наблюдается у видов Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi и Vibrio harveyi . Излучение света некоторыми биолюминесцентными бактериями использует «антенну», такую ​​как «белок люмазин», чтобы принимать энергию из первичного возбужденного состояния люциферазы, в результате чего возникает возбужденный хромофор лульназина, который излучает свет с более короткой длиной волны (более синий), тогда как в других случаях используют желтый флуоресцентный белок (YFP) с FMN в качестве хромофора и излучают свет, который смещен в красную область относительно света люциферазы. [5]

Динофлагеллята [ править ]

Динофлагеллят люцифераза является мульти- домена белка, состоящая из N-концевого домена, и три каталитических домены , каждый из которых предшествуют спиральный домен расслоения. Структура из фитопланктона динофлагеллатой люциферазы каталитического домена была решена. [6] Центральная часть домена представляет собой бета-бочонок из 10 цепей , структурно подобный липокалинам и FABP . [6] N-концевой домен является консервативным между динофлагеллат люциферазой и люциферином.связывающие белки (LBP). Было высказано предположение, что эта область может опосредовать взаимодействие между LBP и люциферазой или их ассоциацию с вакуолярной мембраной. [7] Домен спирального пучка имеет трехспиральную структуру пучка, которая содержит четыре важных гистидина, которые, как считается, играют роль в регуляции pH фермента . [6]В β-стволе динофлагеллат люциферазы при pH 8 есть большой карман для размещения тетрапиррольного субстрата, но нет отверстия, позволяющего субстрату проникать. Следовательно, должно произойти значительное конформационное изменение, чтобы обеспечить доступ и пространство для лиганда в активном сайте, и источником этого изменения являются четыре N-концевых остатка гистидина. [6] При pH 8 можно видеть, что непротонированные остатки гистидина участвуют в сети водородных связей на границе раздела спиралей в пучке, которые блокируют доступ субстрата к активному центру и разрушение этого взаимодействия протонированием (при pH 6,3) или заменой остатков гистидина на аланинвызывает большое молекулярное движение пучка, разделяя спирали на 11 Å и открывая каталитический сайт. [6] Логично, что остатки гистидина не могут быть заменены аланином по своей природе, но эта экспериментальная замена дополнительно подтверждает, что более крупные остатки гистидина блокируют активный сайт. Кроме того, три последовательности Gly-Gly, одна в N-концевой спирали и две в мотиве спираль-петля-спираль, могут служить шарнирами, вокруг которых вращаются цепи, чтобы еще больше открыть путь к каталитическому сайту и увеличить активную сайт. [6]

Люцифераза динофлагеллят способна излучать свет из-за ее взаимодействия со своим субстратом ( люциферином ) и люциферин-связывающим белком (LBP) в сцинтиллонной органелле, обнаруженной у динофлагеллятов. [6] Люцифераза действует в соответствии с люциферином и LBP, чтобы излучать свет, но каждый компонент функционирует при разном pH. Люцифераза и ее домены не активны при pH 8, но они чрезвычайно активны при оптимальном pH 6,3, тогда как LBP связывает люциферин при pH 8 и высвобождает его при pH 6,3. [6] Следовательно, люциферин высвобождается для взаимодействия с активной люциферазой только тогда, когда сцинтиллон подкисляется до pH 6,3. Следовательно, чтобы снизить pH, потенциал-зависимые каналы в сцинтилонемембраны открываются, чтобы позволить протонам проникать из вакуоли, обладающей потенциалом действия, возникающим в результате механической стимуляции. [6] Таким образом, можно видеть, что потенциал действия в вакуолярной мембране приводит к подкислению, и это, в свою очередь, позволяет высвобождать люциферин для реакции с люциферазой в сцинтиллоне, производя вспышку синего света.

Механизм реакции [ править ]

Все люциферазы классифицируются как оксидоредуктазы ( EC 1.13.12.- ), что означает, что они действуют на отдельных доноров с включением молекулярного кислорода. Поскольку люциферазы принадлежат к множеству различных семейств белков , которые не связаны между собой, не существует объединяющего механизма, поскольку любой механизм зависит от комбинации люциферазы и люциферина. Однако все охарактеризованные на сегодняшний день реакции люцифераза-люциферин на какой-то стадии требуют молекулярного кислорода .

Бактериальная люцифераза [ править ]

Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, также является окислительным процессом:

  • FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + светлый

В реакции молекулярный кислород окисляет флавинмононуклеотид и длинноцепочечный алифатический альдегид до алифатической карбоновой кислоты . В результате реакции образуется возбужденный промежуточный гидроксифлавин, который дегидратируется до продукта FMN с излучением сине-зеленого света. [8]

Почти вся энергия, вкладываемая в реакцию, превращается в свет. Эффективность реакции составляет от 80% [9] до 90% [10] . Для сравнения, лампа накаливания преобразует только около 10% своей энергии в свет [11], а светодиод 150 люмен на ватт (лм / Вт) преобразует 20% входной энергии в видимый свет. [10]

Приложения [ править ]

Люциферазы могут быть получены в лаборатории с помощью генной инженерии для ряда целей. Гены люциферазы можно синтезировать и вставлять в организмы или трансфицировать в клетки. Мыши , тутовые шелкопряды и картофель - это лишь некоторые из организмов, которые уже были созданы для производства белка. [12]

В реакции люциферазы свет излучается, когда люцифераза действует на соответствующий субстрат люциферина . Эмиссия фотонов может быть обнаружена с помощью светочувствительных приборов, таких как люминометр или модифицированные оптические микроскопы. Это позволяет наблюдать за биологическими процессами. [13] Поскольку для биолюминесценции люциферазы световое возбуждение не требуется, имеется минимальная аутофлуоресценция и, следовательно, флуоресценция практически без фона. [14] Таким образом, всего 0,02 пг можно точно измерить с помощью стандартного сцинтилляционного счетчика. [15]

В биологических исследованиях люцифераза обычно используется в качестве репортера для оценки транскрипционной активности в клетках, трансфицированных генетической конструкцией, содержащей ген люциферазы, под контролем интересующего промотора . [16] Кроме того, пролуминесцентные молекулы, которые превращаются в люциферин при активности определенного фермента, могут использоваться для определения активности фермента в сопряженных или двухэтапных анализах люциферазы. Такие субстраты использовались , среди прочего, для определения активности каспаз и цитохрома Р450 . [13] [16]

Люциферазу также можно использовать для определения уровня клеточного АТФ в анализах жизнеспособности клеток или в анализах киназной активности. [16] [17] Люцифераза может действовать как сенсорный белок АТФ посредством биотинилирования . Биотинилирование будет иммобилизации люциферазы на клеточной поверхности путем связывания с стрептавидин - биотин комплекс. Это позволяет люциферазе обнаруживать истечение АТФ из клетки и эффективно отображать высвобождение АТФ в реальном времени посредством биолюминесценции. [18] Люциферазу можно дополнительно сделать более чувствительной для обнаружения АТФ, увеличив интенсивность люминесценции путем изменения определенных аминокислотных остатков в последовательности белка.[19]

Визуализация всего животного (называемая in vivo при жизни или, иначе, называемая визуализацией ex vivo ) - мощный метод изучения популяций клеток у живых животных, таких как мыши. [20] Различные типы клеток (например, стволовые клетки костного мозга, Т-клетки) могут быть сконструированы для экспрессии люциферазы, что позволяет неинвазивно визуализировать их внутри живого животного с помощью чувствительной камеры устройства с зарядовой парой ( камеры CCD ). был использован для отслеживания туморогенеза и ответа опухолей на лечение на животных моделях. [21] [22]Однако факторы окружающей среды и терапевтические вмешательства могут вызывать некоторые расхождения между опухолевой нагрузкой и интенсивностью биолюминесценции в отношении изменений пролиферативной активности. Интенсивность сигнала, измеренного с помощью визуализации in vivo, может зависеть от различных факторов, таких как абсорбция D-люциферина через брюшину, кровоток, проницаемость клеточных мембран, наличие кофакторов, внутриклеточный pH и прозрачность вышележащих тканей, а также количество люциферазы. [23]

Люцифераза - это термочувствительный белок, который используется в исследованиях денатурации белков для проверки защитных свойств белков теплового шока . Возможности использования люциферазы продолжают расширяться. [24]

См. Также [ править ]

  • Люциферин
  • Биолюминесцентная визуализация
  • Проверка кворума
  • Биолюминесцентные бактерии

Ссылки [ править ]

  1. ↑ Gould SJ, Subramani S (ноябрь 1988 г.). «Люцифераза светлячков как инструмент молекулярной и клеточной биологии». Аналитическая биохимия . 175 (1): 5–13. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (88) 90353-3 . PMID  3072883 .CS1 maint: uses authors parameter (link)
  2. ^ Steghens JP, Min KL, Bernengo JC (ноябрь 1998). «Люцифераза светлячка имеет два нуклеотидных сайта связывания: влияние нуклеозидмонофосфата и КоА на спектры излучения света» . Биохимический журнал . 336 (Pt 1) (1): 109–13. DOI : 10.1042 / bj3360109 . PMC 1219848 . PMID 9806891 .  CS1 maint: uses authors parameter (link)
  3. ^ Шимомура O (1985). «Биолюминесценция в море: фотобелковые системы». Симпозиумы Общества экспериментальной биологии . 39 : 351–72. PMID 2871634 . 
  4. ↑ Huh S, Lee J, Jung E, Kim SC, Kang JI, Lee J, Kim YW, Sung YK, Kang HK, Park D (июнь 2009 г.). «Система на основе клеток для скрининга агентов, способствующих росту волос». Архив дерматологических исследований . 301 (5): 381–85. DOI : 10.1007 / s00403-009-0931-0 . PMID 19277688 . S2CID 23916875 .  
  5. ^ Болдуина, Christopher JA, Raushel FM, Sinclair JF, Зиглер MM, Fisher AJ, Rayment I (декабрь 1995). «Структура бактериальной люциферазы». Текущее мнение в структурной биологии . 5 (6): 798–809. DOI : 10.1016 / 0959-440x (95) 80014-X . PMID 8749369 . 
  6. ^ a b c d e f g h i Schultz LW, Liu L, Cegielski M, Hastings JW (февраль 2005 г.). «Кристаллическая структура pH-регулируемой люциферазы, катализирующей биолюминесцентное окисление открытого тетрапиррола» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (5): 1378–83. DOI : 10.1073 / pnas.0409335102 . PMC 547824 . PMID 15665092 .  
  7. Перейти ↑ Okamoto OK, Liu L, Robertson DL, Hastings JW (декабрь 2001). «Члены семейства генов динофлагеллат люциферазы различаются по скорости синонимичных замен». Биохимия . 40 (51): 15862–68. CiteSeerX 10.1.1.494.3563 . DOI : 10.1021 / bi011651q . PMID 11747464 .  
  8. ^ Fisher AJ, Томпсон TB, Thoden JB, Болдуина, Rayment I (сентябрь 1996). «Кристаллическая структура бактериальной люциферазы с разрешением 1,5 А в условиях с низким содержанием соли» . Журнал биологической химии . 271 (36): 21956–68. DOI : 10.1074 / jbc.271.36.21956 . PMID 8703001 . 
  9. ↑ Элизабет Уилсон (18 января 1999 г.). "Что это за штука?" . Новости химии и техники . 77 (3): 65. DOI : 10.1021 / Сеп-v077n003.p065 .
  10. ^ a b Ванесса Книветт (2009). «Освещая путь» . EE Times . Архивировано из оригинала на 2012-10-05 . Проверено 18 сентября 2011 .
  11. ↑ General Electric TP-110, стр. 23, табл.
  12. ^ CONTAG CH, Bachmann MH (2002). «Достижения in vivo биолюминесцентной визуализации экспрессии генов». Ежегодный обзор биомедицинской инженерии . 4 : 235–60. DOI : 10.1146 / annurev.bioeng.4.111901.093336 . PMID 12117758 . 
  13. ^ a b «Введение в биолюминесцентные анализы» . Корпорация Промега. Архивировано из оригинала на 2010-08-14 . Проверено 7 марта 2009 .
  14. ^ Williams TM, Burlein JE, Огден S, Kricka LJ, Кант JA (январь 1989). «Преимущества люциферазы светлячков как репортерного гена: приложение к промотору гена интерлейкина-2». Аналитическая биохимия . 176 (1): 28–32. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (89) 90267-4 . PMID 2785354 . 
  15. ^ Нгуен В.Т., Morange М, Bensaude О (июнь 1988). «Люминесцентный анализ люциферазы светлячков с использованием сцинтилляционных счетчиков для количественного определения в трансфицированных клетках млекопитающих». Аналитическая биохимия . 171 (2): 404–08. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (88) 90505-2 . PMID 3407940 . 
  16. ^ a b c Fan F, Wood KV (февраль 2007 г.). «Биолюминесцентные анализы для высокопроизводительного скрининга». АНАЛИЗ и технологии разработки лекарств . 5 (1): 127–36. DOI : 10.1089 / adt.2006.053 . PMID 17355205 . 
  17. ^ Meisenheimer PL, O'Brien MA, Cali JJ (сентябрь 2008). «Субстраты люминогенных ферментов: основа новой парадигмы в дизайне анализа» (PDF) . Promega Notes . 100 : 22–26. Архивировано из оригинального (PDF) 06.03.2009 . Проверено 1 октября 2008 .
  18. ^ Nakamura M, Mie M, Фунабаши H, Yamamoto K, J Ando, Kobatake E (май 2006). «Обнаружение АТФ на клеточной поверхности с иммобилизованной люциферазой светлячков». Аналитическая биохимия . 352 (1): 61–67. DOI : 10.1016 / j.ab.2006.02.019 . PMID 16564487 . 
  19. ↑ Fujii H, Noda K, Asami Y, Kuroda A, Sakata M, Tokida A (июль 2007 г.). «Повышение интенсивности биолюминесценции люциферазы светлячков с помощью генетической модификации». Аналитическая биохимия . 366 (2): 131–36. DOI : 10.1016 / j.ab.2007.04.018 . PMID 17540326 . 
  20. ^ Грир LF, Салаи AA (2002). «Визуализация светового излучения от экспрессии люцифераз в живых клетках и организмах: обзор» . Люминесценция . 17 (1): 43–74. DOI : 10.1002 / bio.676 . PMID 11816060 . 
  21. ^ Lyons SK, Meuwissen R, Krimpenfort P, Berns A (ноябрь 2003). «Создание условного репортера, который делает возможным биолюминесцентную визуализацию Cre / loxP-зависимого туморогенеза у мышей» . Исследования рака . 63 (21): 7042–46. PMID 14612492 . 
  22. ↑ Becher OJ, Holland EC (апрель 2006 г.). «Генно-инженерные модели имеют преимущества перед ксенотрансплантатами для доклинических исследований» . Исследования рака . 66 (7): 3355–58, обсуждение 3358–59. DOI : 10.1158 / 0008-5472.CAN-05-3827 . PMID 16585152 . 
  23. ↑ Inoue Y, Tojo A, Sekine R, Soda Y, Kobayashi S, Nomura A, Izawa K, Kitamura T, Okubo T, Ohtomo K (май 2006). «Подтверждение in vitro биолюминесцентного мониторинга прогрессирования заболевания и терапевтического ответа на модельных животных лейкемии». Европейский журнал ядерной медицины и молекулярной визуализации . 33 (5): 557–65. DOI : 10.1007 / s00259-005-0048-4 . PMID 16501974 . S2CID 40630078 .  
  24. ^ Масуд TF, Paulmurugan R, De A, P Ray, Gambhir SS (февраль 2007). «Репортерная визуализация генов белок-белковых взаимодействий у живых субъектов» . Текущее мнение в области биотехнологии . 18 (1): 31–37. DOI : 10.1016 / j.copbio.2007.01.007 . PMC 4141564 . PMID 17254764 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : P08659 (Люциферин-4-монооксигеназа) в PDBe-KB .
  • СМИ, связанные с люциферазой, на Викискладе?
  • Триммер Б., Заяс Р., Кази С., Льюис С., Мишель Т., Дудзински Д., Априлле Дж., Лагас С. (28 июня 2001 г.). «Светлячки и оксид азота» . Университет Тафтса . Проверено 2 октября 2008 .
  • «Тенденции развития репортерных генов» . reportergene.com . Проверено 7 марта 2009 .
  • "BL Web: Люцифериновые типы" . Веб-страница Биолюминесценции . Калифорнийский университет в Санта-Барбаре . Проверено 7 марта 2009 .
  • «Протоколы и руководство по применению репортеров биолюминесценции» . Протоколы и приложения . Корпорация Промега. Архивировано из оригинала на 2010-08-08 . Проверено 7 марта 2009 .
  • "BL Web: Люцифериновые типы" . Энциклопедия науки и философии ISCID . ISCID. Архивировано из оригинала на 2012-09-21 . Проверено 20 апреля 2010 .
  • Дэвид Гудселл. «Люцифераза» . Молекула месяца . Банк данных белков . Проверено 15 января 2013 .
Эта статья включает текст из общественного достояния Pfam и InterPro : IPR018804
Эта статья включает текст из общественного достояния Pfam и InterPro : IPR007959
Эта статья включает текст из общественного достояния Pfam и InterPro : IPR018475