Прогулка праймера (или направленное секвенирование) - это предпочтительный метод секвенирования для секвенирования фрагментов ДНК от 1,3 до 7 тысяч пар оснований . Такие фрагменты слишком длинные, чтобы их можно было секвенировать при чтении одной последовательности с использованием метода терминации цепи . Этот метод работает путем разделения длинной последовательности на несколько последовательных коротких. Интересующая ДНК может быть плазмидной вставкой, продуктом ПЦР или фрагментом, представляющим пробел при секвенировании генома. Термин «прогулка праймера» используется там, где основной целью является секвенирование генома. Термин « хромосомная ходьба»"используется вместо этого, когда последовательность известна, но нет клона гена. Например, ген заболевания может быть расположен рядом с определенным маркером, таким как RFLP в последовательности. [1]
Фрагмент сначала секвенируется, как если бы это был более короткий фрагмент. Секвенирование выполняется с каждого конца с использованием универсальных или специально разработанных праймеров . Это должно идентифицировать первые 1000 или около того баз. Чтобы полностью секвенировать интересующую область, для получения информации о непрерывных последовательностях необходимы конструирование и синтез новых праймеров (комплементарных к последним 20 основаниям известной последовательности). [2]
Процесс
Общий процесс выглядит следующим образом:
- Праймера , который соответствует началу ДНК к последовательности используются для синтеза короткой цепи ДНК , прилегающей к неизвестной последовательности, начиная с праймером (см ПЦРА ).
- Новая короткая цепь ДНК секвенируется с использованием метода терминации цепи.
- Конец секвенированной цепи используется в качестве праймера для следующей части длинной последовательности ДНК, отсюда и термин «ходьба».
Этот метод можно использовать для секвенирования целых хромосом (отсюда «ходьба по хромосомам»). [3] Прогулка праймеров также послужила основой для разработки методики секвенирования , в которой используются случайные праймеры вместо специально выбранных.
Смотрите также
- Хромосомный скачок
- Посадка хромосомы
- Секвенирование дробовиком - альтернативный метод, использующий случайные, а не последовательные субцепи.
Рекомендации
- ^ Cann, Алан (1999). ДНК-вирусы: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-963718-8.
- ^ Стерки, Фредрик; Лундеберг, Йоаким (2000). «Анализ последовательности генов и геномов» (PDF) . Журнал биотехнологии . 76 (1): 1–31. DOI : 10.1016 / s0168-1656 (99) 00176-5 . PMID 10784293 .
- ^ Чинаолт, А. Крейг; Джон Карбон (февраль 1979 г.). «Скрининг перекрывающейся гибридизации: выделение и характеристика перекрывающихся фрагментов ДНК, окружающих ген leu2 на хромосоме III дрожжей». Джин . 5 (2): 111–126. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (79) 90097-0 . PMID 376402 .