Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Кристаллы белков, выращенные на космическом шаттле США или Российской космической станции, Мир .

Кристаллизация белка - это процесс образования регулярного набора отдельных белковых молекул, стабилизированных кристаллическими контактами. Если кристалл достаточно упорядочен, он будет дифрагировать . Некоторые белки естественным образом образуют кристаллические массивы, как аквапорин в хрусталике глаза. [1]

В процессе кристаллизации белков белки растворяются в водной среде и растворе пробы до тех пор, пока не достигнут перенасыщенного состояния . [2] Для достижения этого состояния используются различные методы, такие как диффузия пара, микродиализ, микродиализ и диффузия через свободный интерфейс. Развитие кристаллов белка - сложный процесс, на который влияют многие факторы, в том числе pH, температура, ионная сила в растворе для кристаллизации и даже сила тяжести. [2] После образования эти кристаллы могут быть использованы в структурной биологии для изучения молекулярной структуры белка, в частности, для различных промышленных или медицинских целей. [3] [4]

Развитие кристаллизации белков [ править ]

Более 150 лет ученым известно о кристаллизации белковых молекул. [5]

Кристаллы гемоглобина SC под микроскопом.

В 1840 году Фридрих Людвиг Хюнефельд случайно обнаружил образование кристаллического материала в образцах крови дождевого червя, помещенных под двумя предметными стеклами, и иногда наблюдал небольшие пластинчатые кристаллы в высушенных образцах крови свиней или человека. Эти кристаллы были названы «гемоглобином» Феликсом Хоппе-Зейлером в 1864 году. Основополагающие открытия Хюнефельда вдохновили многих ученых в будущем. [6]

В 1851 году Отто Функе описал процесс получения кристаллов человеческого гемоглобина путем разбавления эритроцитов растворителями, такими как чистая вода, спирт или эфир, с последующим медленным испарением растворителя из раствора белка. В 1871 году профессор Йенского университета Уильям Т. Прейер опубликовал книгу под названием Die Blutkrystalle (Кристаллы крови), в которой рассмотрел особенности кристаллов гемоглобина около 50 видов млекопитающих, птиц, рептилий и рыб. [6]

В 1909 году физиолог Эдвард Т. Райхерт вместе с минералогом Амосом П. Брауном опубликовали трактат о получении, физиологии и геометрических характеристиках кристаллов гемоглобина нескольких сотен животных, включая вымершие виды, такие как тасманский волк. [6] Были обнаружены увеличивающиеся кристаллы протеина.

В 1934 году Джон Десмонд Бернал и его ученица Дороти Ходжкин обнаружили, что кристаллы белка, окруженные их маточным раствором, дают лучшие дифракционные картины, чем высушенные кристаллы. Используя пепсин , они первыми смогли различить дифрактограмму влажного глобулярного белка. До Бернала и Ходжкина кристаллография белков выполнялась только в сухих условиях с непоследовательными и ненадежными результатами. Это первая рентгенограмма кристалла белка. [7]

В 1958 году Джон Кендрю впервые сообщил о структуре миоглобина (красный белок, содержащий гем), определенном с помощью рентгеновской кристаллографии . [8] Кендрю разделила Нобелевскую премию по химии 1962 года с Максом Перуцем за это открытие. [3]

Теперь, основываясь на кристаллах белка, их структуры играют важную роль в биохимии и трансляционной медицине.

Основы кристаллизации белков [ править ]

Кристаллы лизоцима наблюдаются через поляризационный фильтр.

Теория кристаллизации белков [ править ]

Суть образования кристаллов заключается в том, чтобы раствор образца достиг пересыщенного состояния. [2] Перенасыщение определено McPherson et al. 2014 как «неравновесное состояние, при котором некоторое количество макромолекулы, превышающее предел растворимости, при определенных химических и физических условиях, тем не менее, присутствует в растворе». [2] Образование твердых частиц в растворе, таких как агрегаты и кристаллы, способствует восстановлению равновесия. Система хочет восстановить равновесие, чтобы каждый компонент в выражении энергии был минимальным. [2] В выражение энергии входят три основных фактора: энтальпия (∆H), энтропия (∆S) и температура (T). [9]∆H в этом выражении относится к ∆H химических связей, которые образуются и разрываются в результате реакций или фазовых переходов. [9] ∆S относится к степени свободы или измерению неопределенности, которую могут иметь молекулы. [9] Спонтанность процесса, свободная энергия Гибба (∆G), определяется как ∆G = ∆H- T∆S. [9] Следовательно, увеличение ∆S или уменьшение ∆H способствует спонтанности всего процесса, делая ∆G более отрицательным, таким образом достигая минимального энергетического состояния системы. [9] Когда образуются кристаллы, молекулы белка становятся более упорядоченными, что приводит к уменьшению ∆S и делает ∆G более положительным. [10]Следовательно, спонтанная кристаллизация требует достаточно отрицательного ∆H, чтобы преодолеть потерю энтропии из более упорядоченной системы. [10]

Молекулярный взгляд на переход от раствора к кристаллу [ править ]

Формирование кристаллов требует двух этапов: зарождения и роста. [2] Зарождение ядра - это этап инициации кристаллизации. [2] На стадии зародышеобразования белковые молекулы в растворе объединяются в агрегаты, образуя стабильное твердое ядро. [2] По мере образования ядра кристалл становится все больше и больше за счет молекул, прикрепленных к этому стабильному ядру. [2] Этап зародышеобразования имеет решающее значение для образования кристаллов, поскольку это фазовый переход первого рода для образцов, переходящих от высокой степени свободы к упорядоченному состоянию (от водного к твердому). [2]Для успешной стадии зародышеобразования необходимо изменение параметров кристаллизации. Подход, лежащий в основе кристаллизации белка, заключается в том, чтобы снизить растворимость целевого белка в растворе. [2] После превышения предела растворимости и появления кристаллов кристаллизация завершается. [2]

Методы кристаллизации белков [ править ]

Диффузия пара [ править ]

Три метода приготовления кристаллов: A: висящая капля. B: Падение сидя. C: микродиализ

Диффузия пара - наиболее часто используемый метод кристаллизации белка. В этом методе капли, содержащие очищенный белок, буфер и осадитель, уравновешиваются с большим резервуаром, содержащим аналогичные буферы и осадители в более высоких концентрациях. Первоначально капля белкового раствора содержит сравнительно низкие концентрации осадителя и белка, но по мере уравновешивания капли и резервуара концентрации осадителя и белка в капле возрастают. Если для данного белка используются соответствующие растворы для кристаллизации, в капле происходит рост кристаллов. [11] [12] Этот метод используется потому, что он позволяет мягко и постепенно изменять концентрацию белка и концентрацию осадителя, что способствует росту крупных и хорошо упорядоченных кристаллов.

Диффузия пара может осуществляться как висячей, так и в вертикальной форме. Аппарат "висящая капля" включает каплю раствора белка, помещенную на перевернутое покровное стекло, которое затем подвешивается над резервуаром. Аппарат для кристаллизации сидячей капли помещает каплю на пьедестал, отделенный от резервуара. Оба эти метода требуют герметизации окружающей среды, чтобы могло произойти уравновешивание между каплей и резервуаром. [11] [13]

Microbatch [ править ]

Микропакет обычно включает погружение очень небольшого объема капель белка в масло (всего 1 мкл). Причина, по которой требуется масло, заключается в том, что используется такой малый объем белкового раствора и, следовательно, необходимо предотвратить испарение для проведения эксперимента в водном режиме. Хотя можно использовать различные масла, два наиболее распространенных герметика - это парафиновые масла (описанные Chayen et al.) И силиконовые масла (описанные D'Arcy). Существуют также другие методы микродозирования, в которых не используется жидкий герметизирующий агент, а вместо этого требуется, чтобы ученый быстро наклеил пленку или ленту на пластину с отверстиями после помещения капли в лунку.

Помимо очень ограниченного количества необходимого образца, этот метод также имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что образцы защищены от загрязнения воздухом, поскольку они никогда не подвергаются воздействию воздуха во время эксперимента.

Микродиализ [ править ]

Микродиализ использует полупроницаемую мембрану, через которую могут проходить небольшие молекулы и ионы, в то время как белки и крупные полимеры не могут проходить. Устанавливая градиент концентрации растворенного вещества на мембране и позволяя системе двигаться к равновесию, система может медленно двигаться в сторону перенасыщения, при котором могут образовываться кристаллы белка.

Микродиализ может производить кристаллы путем высаливания с использованием высоких концентраций соли или других небольших проницаемых для мембран соединений, которые снижают растворимость белка. В очень редких случаях некоторые белки могут кристаллизоваться путем диализа, солей, диализа против чистой воды, удаления растворенных веществ, самоассоциации и кристаллизации.

Распространение свободного интерфейса [ править ]

Этот метод объединяет белковые и осаждающие растворы без их предварительного смешивания, а вместо этого вводит их через обе стороны канала, обеспечивая равновесие за счет диффузии. Два раствора вступают в контакт в камере для реагентов, оба при максимальной концентрации, инициируя спонтанное зародышеобразование. Когда система приходит в равновесие, уровень пересыщения уменьшается, что способствует росту кристаллов. [14]

Факторы, влияющие на кристаллизацию белка [ править ]

pH [ править ]

Основная движущая сила кристаллизации белка - это оптимизация количества связей, которые можно образовать с другим белком посредством межмолекулярных взаимодействий. [2] Эти взаимодействия зависят от электронной плотности молекул и боковых цепей белка, которые изменяются в зависимости от pH. [9] Третичная и четвертичная структура белков определяется межмолекулярными взаимодействиями между боковыми группами аминокислот, в которых гидрофильные группы обычно обращены наружу к раствору, образуя гидратную оболочку для растворителя (воды). [9]При изменении pH заряд на этих полярных боковых группах также изменяется в зависимости от pH раствора и pKa белка. Следовательно, выбор pH важен либо для содействия образованию кристаллов, где связь между молекулами друг с другом более благоприятна, чем с молекулами воды. [9] pH - одна из самых мощных манипуляций, которые можно назначить для оптимальных условий кристаллизации.

Температура [ править ]

Температура - еще один интересный параметр для обсуждения, поскольку растворимость белка зависит от температуры. [15] При кристаллизации белка одной из распространенных стратегий является изменение температуры для получения успешных кристаллов. В отличие от pH, температура различных компонентов кристаллографических экспериментов может повлиять на конечные результаты, такие как температура приготовления буфера, [16] температура фактического эксперимента по кристаллизации и т. Д.

Химические добавки [ править ]

Химические добавки - это небольшие химические соединения, которые добавляют в процессе кристаллизации для увеличения выхода кристаллов. [17] Роль малых молекул в кристаллизации белка не была хорошо изучена в первые дни, так как в большинстве случаев они рассматривались как загрязнители. [17] Более мелкие молекулы кристаллизуются лучше, чем макромолекулы, такие как белки, поэтому использование химических добавок было ограничено до исследования Макферсона. Тем не менее, это важный аспект экспериментальных параметров кристаллизации, который важен для биохимиков и кристаллографов для дальнейшего изучения и применения. [17]

Технологии, способствующие кристаллизации белка [ править ]

Скрининг кристаллизации с высокой пропускной способностью [18] [ править ]

Существуют высокопроизводительные методы, которые помогают упростить большое количество экспериментов, необходимых для изучения различных условий, необходимых для успешного роста кристаллов. Для заказа доступны многочисленные рекламные наборы, в которых предварительно собранные ингредиенты используются в системах, гарантирующих успешную кристаллизацию. Используя такой набор, ученый избегает хлопот по очистке белка и определению подходящих условий кристаллизации.

Роботы для работы с жидкостями могут использоваться для одновременной настройки и автоматизации большого количества экспериментов по кристаллизации. То, что в противном случае было бы медленным и потенциально подверженным ошибкам процессом, выполняемым человеком, может быть выполнено эффективно и точно с помощью автоматизированной системы. В роботизированных системах кристаллизации используются те же компоненты, которые описаны выше, но каждый этап процедуры выполняется быстро и с большим количеством повторов. В каждом эксперименте используются крошечные количества раствора, и меньший размер имеет двойное преимущество: меньшие размеры образцов не только сокращают расход очищенного белка, но и меньшие количества раствора приводят к более быстрой кристаллизации. За каждым экспериментом следит камера, которая фиксирует рост кристаллов. [12]

Белковая инженерия [ править ]

Белки могут быть сконструированы таким образом, чтобы повысить вероятность успешной кристаллизации белков с помощью таких методов, как уменьшение поверхностной энтропии [19] или инженерия в контактах с кристаллами. [20] Часто проблемные остатки цистеина можно заменить аланином, чтобы избежать агрегации, опосредованной дисульфидом , а остатки, такие как лизин, глутамат и глутамин, можно заменить на аланин, чтобы снизить внутреннюю гибкость белка, что может препятствовать кристаллизации.

Применение кристаллографии белков [ править ]

Высокомолекулярные структуры могут быть определены из белкового кристалла с использованием различных методов, в том числе дифракции рентгеновских лучей / рентгеновской кристаллографии , Криогенная электронная микроскопия (CryoEM) ( в том числе электронным кристаллографии и микрокристаллическая дифракции электронов (MicroEd) ), малоуглового рентгеновского рассеяние и дифракция нейтронов . См. Также Структурная биология .

Кристаллизация белков также может быть полезна при приготовлении белков для фармацевтических целей. [21]

См. Также [ править ]

  • Кристалл инженерия
  • Рост кристаллов
  • Кристаллическая оптика
  • Кристаллическая система
  • Процессы кристаллизации
  • Кристаллографическая база данных
  • Кристаллографическая группа
  • Дифракция
  • Электронная кристаллография
  • Электронная дифракция
  • Нейтронная кристаллография
  • Нейтронная дифракция
  • Структурная биология
  • дифракция рентгеновских лучей

Ссылки [ править ]

  1. ^ Шей, Кевин Л .; Ван, Чжэнь; Л. Венке, Джейми; Ци, Инь (май 2014 г.). «Аквапорины в глазу: выражение, функции и роль в глазных заболеваниях» . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Общие предметы . 1840 (5): 1513–1523. DOI : 10.1016 / j.bbagen.2013.10.037 . PMC  4572841 . PMID  24184915 .
  2. ^ Б с д е е г ч я J к л м МакФерсон, Александр; Гавира, Хосе А. (24 декабря 2013 г.). «Введение в кристаллизацию белков» . Acta Crystallographica Раздел F . 70 (1): 2–20. DOI : 10.1107 / s2053230x13033141 . ISSN 2053-230X . PMC 3943105 . PMID 24419610 .   
  3. ^ a b Бланделл, Том Л. (29.06.2017). «Кристаллография белков и открытие лекарств: воспоминания об обмене знаниями между академией и промышленностью» . IUCrJ . 4 (4): 308–321. DOI : 10.1107 / s2052252517009241 . ISSN 2052-2525 . PMC 5571795 . PMID 28875019 .   
  4. ^ Трипатия, Дебу; Бардия, Адитья; Продавцы, Уильям Р. (28 марта 2017 г.). «Рибоциклиб (LEE011): механизм действия и клиническое воздействие этого селективного циклин-зависимого ингибитора киназы 4/6 в различных солидных опухолях» . Клинические исследования рака . 23 (13): 3251–3262. DOI : 10.1158 / 1078-0432.ccr-16-3157 . ISSN 1078-0432 . PMC 5727901 . PMID 28351928 .   
  5. ^ Макферсон, Александр (март 1991). «Краткая история роста кристаллов белка». Журнал роста кристаллов . 110 (1–2): 1–10. Bibcode : 1991JCrGr.110 .... 1M . DOI : 10.1016 / 0022-0248 (91) 90859-4 . ISSN 0022-0248 . 
  6. ^ a b c Giegé, Ричард (декабрь 2013 г.). «Исторический взгляд на кристаллизацию белка с 1840 года до наших дней» . Журнал FEBS . 280 (24): 6456–6497. DOI : 10.1111 / febs.12580 . ISSN 1742-4658 . PMID 24165393 .  
  7. ^ Tulinsky, A. (1996), Глава 35. Белок Структура проекта, 1950-1959: Первый Согласованный Усилием Определение белка в Structure в США , годовые отчеты в медицинской химии, 31 , Elsevier, стр 357-366,. DOI : 10.1016 / s0065-7743 (08) 60474-1 , ISBN 9780120405312
  8. ^ КЕНДРЮ, JC; BODO, G .; DINTZIS, HM; PARRISH, RG; WYCKOFF, H .; ФИЛЛИПС, округ Колумбия (март 1958 г.). «Трехмерная модель молекулы миоглобина, полученная с помощью рентгеновского анализа». Природа . 181 (4610): 662–666. Bibcode : 1958Natur.181..662K . DOI : 10.1038 / 181662a0 . ISSN 0028-0836 . PMID 13517261 .  
  9. ^ a b c d e f g h Бойл, Джон (январь 2005 г.). "Принципы биохимии Ленингера (4-е изд.): Нельсон, Д., и Кокс, М." Биохимия и молекулярная биология образования . 33 (1): 74–75. DOI : 10.1002 / bmb.2005.494033010419 . ISSN 1470-8175 .  
  10. ^ a b Макферсон, Александр (апрель 1990 г.). «Современные подходы к кристаллизации макромолекул» . Европейский журнал биохимии . 189 (1): 1-23. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1990.tb15454.x . ISSN 0014-2956 . PMID 2185018 .  
  11. ^ a b Rhodes, G. (2006) Crystallography Made Crystal Clear, Third Edition: A Guide for Users of Macromolecular Models, 3rd Ed., Academic Press.
  12. ^ а б «Кристальный робот» . Декабрь 2000 . Проверено 18 февраля 2003 .
  13. ^ Макри D (1993). Практическая кристаллография белков . Сан-Диего: Academic Press. С. 1–23. ISBN 978-0-12-486052-0.
  14. ↑ Рупп, Бернхард (20 октября 2009 г.). Биомолекулярная кристаллография: принципы, практика и применение в структурной биологии . Наука о гирляндах. п. 800. ISBN 9781134064199. Проверено 28 декабря +2016 .
  15. ^ Пелегрин, DHG; Гаспаретто, Калифорния (февраль 2005 г.). «Растворимость сывороточных белков в зависимости от температуры и pH». LWT - Пищевая наука и технологии . 38 (1): 77–80. DOI : 10.1016 / j.lwt.2004.03.013 . ISSN 0023-6438 . 
  16. ^ Чен, Жуй-Цин; Лу, Цинь-Цинь; Ченг, Цин-Ди; Ао, Лян-Бо; Чжан, Чен-Ян; Хоу, Хай; Лю, Юн-Мин; Ли, Да-Вэй; Инь, Да-Чуань (19 января 2015 г.). «Игнорируемая переменная: температура приготовления раствора при кристаллизации белка» . Научные отчеты . 5 (1): 7797. Bibcode : 2015NatSR ... 5E7797C . DOI : 10.1038 / srep07797 . ISSN 2045-2322 . PMC 4297974 . PMID 25597864 .   
  17. ^ a b c Макферсон, Александр; Кадни, Боб (декабрь 2006 г.). «В поисках серебряных пуль: альтернативная стратегия кристаллизации макромолекул» (PDF) . Журнал структурной биологии . 156 (3): 387–406. DOI : 10.1016 / j.jsb.2006.09.006 . ISSN 1047-8477 . PMID 17101277 .   
  18. ^ Лин, Ибинь (20 апреля 2018 г.). «Что произошло за последние пять лет с высокопроизводительным скринингом кристаллизации белка?» . Мнение эксперта об открытии лекарств . 13 (8): 691–695. DOI : 10.1080 / 17460441.2018.1465924 . PMID 29676184 . 
  19. ^ Купер, Дэвид Р .; Бочек, Томаш; Грелевская, Катаржина; Пинковская, Малгожата; Сикорска, Малгожата; Завадски, Михал; Деревенда, Зигмунт (01.05.2007). «Кристаллизация белка путем уменьшения поверхностной энтропии: оптимизация стратегии SER» . Acta Crystallographica Раздел D . 63 (5): 636–645. DOI : 10.1107 / S0907444907010931 . ISSN 0907-4449 . PMID 17452789 .  
  20. ^ Gonen, S .; DiMaio, F .; Gonen, T .; Бейкер, Д. (19.06.2015). «Дизайн упорядоченных двумерных массивов, опосредованных нековалентными межбелковыми интерфейсами» . Наука . 348 (6241): 1365–1368. Bibcode : 2015Sci ... 348.1365G . DOI : 10.1126 / science.aaa9897 . ISSN 0036-8075 . PMID 26089516 .  
  21. ↑ Jen, A., and Merkle, HP (2001) «Необработанные алмазы: кристаллы белка с точки зрения рецептуры». Pharm Res 18, 1483–1488.

Внешние ссылки [ править ]

  • «Кристаллизация белка и немая удача». Эссе Боба Кадни о случайной стороне кристаллизации белка: http://www.rigaku.com/downloads/journal/Vol16.2.1999/cudney.pdf
  • Оуэнс, Рэй. «Белковые кристаллы» . Закулисная наука . Брэди Харан .
  • Эта страница была воспроизведена (с изменениями) с явного согласия доктора А. Малькольма Кэмпбелла. По состоянию на 2010 год исходную страницу можно найти по адресу http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Kogoy/protein.html.