Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Хроматография с обращенной фазой (также называемая RPC , обращенно-фазовая хроматография или гидрофобная хроматография ) включает любой хроматографический метод, в котором используется гидрофобная стационарная фаза . [1] RPC относится к жидкостной (а не газовой) хроматографии.

Стационарные фазы [ править ]

В 1970-х годах большая часть жидкостной хроматографии выполнялась с использованием неподвижной фазы на твердом носителе (также называемой колонкой), содержащей немодифицированные кремнеземные или глиноземистые смолы. Этот тип техники теперь называется нормально-фазовой хроматографией . Поскольку в этом методе неподвижная фаза является гидрофильной , молекулы с гидрофильными свойствами, содержащиеся в подвижной фазе, будут иметь высокое сродство к неподвижной фазе и, следовательно, будут адсорбироваться на насадке колонки. Гидрофобные молекулы обладают меньшим сродством к насадке колонки и будут проходить через нее для элюирования.и обнаружен первым. Элюирование гидрофильных молекул, адсорбированных на насадке колонки, требует использования более гидрофильных или более полярных растворителей в подвижной фазе, чтобы сместить распределение частиц в неподвижной фазе в сторону распределения частиц в подвижной фазе.

Хроматография с обращенной фазой - это метод, в котором алкильные цепи ковалентно связаны с частицами неподвижной фазы для создания гидрофобной неподвижной фазы, которая имеет более сильное сродство к гидрофобным или менее полярным соединениям. Использование гидрофобной неподвижной фазы по существу является противоположностью хроматографии с нормальной фазой, поскольку полярность подвижной и неподвижной фаз поменялась местами - отсюда и термин обращенно-фазовая хроматография. [2] [3] В обращенно-фазовой хроматографии используется полярная ( водная ) подвижная фаза. В результате гидрофобные молекулы в полярной подвижной фазе имеют тенденцию адсорбироваться на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофильныемолекулы подвижной фазы проходят через колонку и элюируются первыми. [2] [4] Гидрофобные молекулы можно элюировать из колонки, уменьшив полярность подвижной фазы с помощью органического (неполярного) растворителя, который снижает гидрофобные взаимодействия. Чем более гидрофобна молекула, тем сильнее она будет связываться с неподвижной фазой и тем более высокая концентрация органического растворителя потребуется для элюирования молекулы.

Многие математические и экспериментальные соображения, используемые в других хроматографических методах, также применимы к RPC (например, разрешение разделениязависит от длины столбца). Его можно использовать для разделения самых разных молекул. Обычно он не используется для разделения белков, потому что органические растворители, используемые в RPC, могут денатурировать многие белки. По этой причине для разделения белков чаще используется нормально-фазовая хроматография. Однако денатурация белков может быть полезной при более позднем анализе образцов, полученных с помощью хроматографии. Если на анализируемых белках проводится ферментативное расщепление трипсином, для этого больше подходит линеаризованный белок. Следовательно, денатурация белков с использованием подходящих растворителей, которые вызывают разворачивание белков, на самом деле может быть преднамеренной перед взятием фракционированного образца с помощью масс-спектрометрии.

Сегодня RPC - это часто используемый аналитический метод. Существует множество стационарных фаз, доступных для использования в RPC, что обеспечивает большую гибкость при разработке методов разделения.

Стационарные фазы на основе кремнезема [ править ]

Любое инертное полярное вещество, которое обеспечивает достаточную упаковку, можно использовать для обращенно-фазовой хроматографии. Самая популярная колонка представляет собой диоксид кремния, связанный с октадецильной углеродной цепью (C18) (классификация USP L1). [5] Далее следуют диоксид кремния, связанный с С8 (L7), чистый диоксид кремния (L3), диоксид кремния с циано-связью (L10) и диоксид кремния с фенильной связью (L11). Обратите внимание, что C18, C8 и фенил являются специальными смолами с обращенной фазой, в то время как цианоколонки могут использоваться в режиме с обращенной фазой в зависимости от аналита и условий подвижной фазы. Не все колонки C18 обладают одинаковыми удерживающими свойствами. Функционализацию поверхности диоксида кремния можно проводить в мономерной или полимерной реакции с различными короткоцепочечными органосиланами, используемыми на втором этапе, чтобы покрыть оставшиеся силанольные группы (блокирование концов). Хотя общий механизм удерживания остается неизменным, небольшие различия в химическом составе поверхности различных неподвижных фаз приведут к изменениям в селективности.

Современные колонны имеют разную полярность. ПФП - пентафторфенил. CN - циано. NH2 - это амино. ODS - октадецил или C18. ODCN представляет собой колонку смешанного режима, состоящую из C18 и нитрила. SCX - это сильный катионный обмен (используется для разделения органических аминов). SAX - это сильный анионный обмен (используется для разделения соединений карбоновых кислот).

Мобильные фазы [ править ]

Смеси воды или водных буферов и органических растворителей используются для элюирования аналитов из обращенно-фазовой колонки. [2] Растворители должны смешиваться с водой, и наиболее распространенными используемыми органическими растворителями являются ацетонитрил , метанол и тетрагидрофуран (ТГФ). Можно использовать другие растворители, такие как этанол или 2-пропанол (изопропиловый спирт). Элюирование может выполняться изократически (состав воды и растворителя не изменяется в процессе разделения) или с использованием градиента раствора (состав воды и растворителя изменяется в процессе разделения, обычно за счет уменьшения полярности). PH подвижной фазы может иметь важное значение для удержания аналита и может изменять селективность некоторых аналитов.

Заряженные аналиты можно разделить на колонке с обращенной фазой с помощью ионного спаривания (также называемого ионным взаимодействием). Этот метод известен как обращенно-фазовая ионно-парная хроматография.

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ ИЮПАК , Сборник химической терминологии , 2-е изд. («Золотая книга») (1997). Исправленная онлайн-версия: (2006–) « обращенно-фазовая хроматография ». DOI : 10,1351 / goldbook.R05376
  2. ^ a b c Акул Мехта (27 декабря 2012 г.). «Принцип обращенно-фазовой хроматографии ВЭЖХ / УЭЖХ (с анимацией)» . PharmaXChange . Проверено 10 января 2013 года .
  3. ↑ Я Мольнар и К. Хорват (сентябрь 1976 г.). «Обратно-фазовая хроматография полярных биологических веществ: разделение катехиновых соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» . Клиническая химия . 22 (9): 1497–1502. PMID 8221 . Проверено 10 января 2013 года . 
  4. ^ (Клиническая биохимия, TWHrubey, 54)
  5. ^ Хроматографические реагенты USP 2007-2008: Используется в USP-NF и Фармакопейном форуме . Фармакопея США. 2007 г.

Внешние ссылки [ править ]

  • Таблицы, обобщающие различные типы обратных фаз и информацию о процессе функционализации