Chromotest SOS представляет собой биологический анализ , чтобы оценить генотоксический потенциал химических соединений. Тест представляет собой колориметрический анализ, который измеряет экспрессию генов, индуцированных генотоксическими агентами в Escherichia coli , посредством слияния со структурным геном β-галактозидазы . Тест проводится в течение нескольких часов в колонках 96-луночного микропланшета с возрастающими концентрациями тестируемых образцов. Этот тест был разработан как практическое дополнение или альтернатива традиционному тесту Эймса на генотоксичность., который включает выращивание бактерий на чашках с агаром и сравнение частоты естественных мутаций с частотой мутаций бактерий, подвергшихся воздействию потенциально мутагенных соединений или образцов. Хромотест SOS сравним по точности и чувствительности с известными методами, такими как тест Эймса, и является полезным инструментом для скрининга генотоксичных соединений, которые могут оказаться канцерогенными для человека, с целью выделения химических веществ для дальнейшего углубленного анализа. [1] [2]
Как и в случае других тестов бактериальной гентоксичности и мутагенности, соединения, требующие метаболической активации для активности, могут быть исследованы с добавлением экстракта микросомальной печени крысы S9.
Механизм [ править ]
Ответ SOS играет центральную роль в ответ кишечной палочки до генотоксических соединений , так как он реагирует на широкий спектр химических агентов. Срабатывание этой системы может использоваться и использовалось как ранний признак повреждения ДНК. Два гена играют ключевую роль в SOS-ответе: lexA кодирует репрессор для всех генов в системе, а recA кодирует белок, способный расщеплять репрессор LexA при активации сигналом, индуцирующим SOS (в данном случае вызванным присутствием генотоксическое соединение). Хотя точный механизм SOS-ответа все еще неизвестен, он индуцируется, когда повреждения ДНК нарушают или останавливают репликацию ДНК. . [3]
Различные конечные точки являются возможными индикаторами срабатывания системы SOS; активация белка RecA, расщепление репрессора LexA, экспрессия любого из генов SOS и т. д. Один из простейших анализов состоит в мониторинге экспрессии гена SOS посредством слияния с lacZ, структурным геном E. coli. β-галактозидаза.
Процедура [ править ]
Хромотест SOS заключается в инкубации кишечной палочки с возрастающими концентрациями исследуемого химического вещества. После предоставления времени для синтеза белка активность β-галактозидазы анализируется с помощью простого колориметрического анализа. За счет включения аналога лактозы, который дает окрашенное соединение при разложении, легко наблюдаемое или поддающееся количественной оценке изменение цвета используется в качестве показателя. Поскольку тестируемое химическое вещество может ингибировать синтез белка при более высоких концентрациях, что привело бы к недооценке индукции B-галактозидазы, щелочную фосфатазу анализируют одновременно с β-галактозидазой, чтобы масштабировать данные до выживаемости клеток.
Анализ можно легко завершить за несколько часов. При использовании считывающего устройства для микропланшетов тест является количественным, и кривые зависимости от дозы имеют начальную линейную область. Наклон этой линейной области позволяет однозначно связать каждое соединение с одним параметром, SOS-индуцирующей активностью (SOSIP), которая отражает индуцирующую активность соединения. [4]
Этот анализ обеспечивает как качественное (видимое наблюдение градиента цвета) для целей скрининга, так и количественное измерение (спектрофотометрия) для расчета общепринятых показателей. В количественном анализе доза-ответ (производство цвета, связанное с производством бета-галактозидазы) соединения наносится на график с наклоном начальной линейной области, используемой в качестве универсального параметра, SOS-индуцирующей активности (SOSIP), которая отражает способность соединения вызывать SOS-ответ (измеряется косвенно по продукции бета-галактозидазы и распаду аналога лактозы). Обычно аналог лактозы представляет собой X-Gal., который дает синий цвет при расщеплении бета-галактозидазой. Дозовая реакция также масштабируется выживаемостью клеток, измеряемой по расщеплению щелочной фосфатазы (которая дает желтый цвет), что позволяет рассчитать SOSIP.
Хотя SOSIP - это показатель, основанный на концентрации, тот же метод можно использовать для сложных смесей окружающей среды, где концентрация или даже интересующие соединения неизвестны. Посредством расчета промежуточного фактора индукции SOS (SOSIF), который может быть нанесен на график в зависимости от разбавления таким же образом, чтобы дать иллюстрацию реакции на дозу без предварительных аналитических измерений образцов.
Преимущества [ править ]
Хромотест SOS считается самым простым и быстрым краткосрочным тестом на генотоксичность. Он служит полезным и экономичным дополнением к традиционному тесту Эймса по ряду причин. Во-первых, из-за своей простоты и быстроты SOS-хромотест может использоваться в качестве скринингового теста на большое количество потенциально генотоксичных соединений. Во-вторых, это может позволить обнаруживать генотоксичные химические вещества, которые дают ложноотрицательные результаты в тесте Эймса (например, эстрадиол, соединение, вызывающее растущее беспокойство). В-третьих, это может оказаться эффективным методом распознавания ложноположительных результатов теста Эймса.
Ссылки [ править ]
- ^ Mohn GR (сентябрь 1981). «Бактериальные системы для тестирования канцерогенности». Мутат. Res . 87 (2): 191–210. DOI : 10.1016 / 0165-1110 (81) 90032-4 . PMID 6799816 .
- ^ Приобрести IF (июль 1982 г.). «Международная комиссия по защите от мутагенов и канцерогенов в окружающей среде. Рабочий документ ICPEMC 2/6. Оценка прогностических тестов на канцерогенность». Мутат. Res . 99 (1): 53–71. DOI : 10.1016 / 0165-1110 (82) 90031-8 . PMID 6811893 .
- ^ Quillardet, Hofnung (1993). «Хромотест SOS: обзор». Мутационные исследования . 297 (3): 235–279. DOI : 10.1016 / 0165-1110 (93) 90019-J . PMID 7692273 .
- ^ Quillardet P, Huisman O, D'Ари R, Hofnung M (октябрь 1982). «Хромотест SOS, прямой анализ индукции функции SOS у Escherichia coli K-12 для измерения генотоксичности» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 79 (19): 5971–5. Bibcode : 1982PNAS ... 79.5971Q . DOI : 10.1073 / pnas.79.19.5971 . PMC 347033 . PMID 6821127 .
