Визуализация оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения

Визуализация оптических флуктуаций со сверхвысоким разрешением (SOFI) - это метод постобработки для вычисления изображений со сверхвысоким разрешением из временных рядов записанных изображений, который основан на временных корреляциях независимо колеблющихся флуоресцентных излучателей.

SOFI был разработан для сверхразрешения биологических образцов, помеченных независимо флуоресцентными излучателями (органические красители, флуоресцентные белки ). По сравнению с другими методами микроскопии сверхвысокого разрешения , такими как STORM или PALM, которые полагаются на локализацию одной молекулы и, следовательно, допускают только одну активную молекулу на дифракционно-ограниченную область (DLA) и точку времени, ^{[1] [2]} SOFI не требует контролируемое фотопереключение и / или фотоактивация, а также длительное время визуализации. ^{[3] [4]}Тем не менее, для этого по-прежнему требуются флуорофоры, которые циклически проходят через два различимых состояния: либо реальные включенные / выключенные состояния, либо состояния с различной интенсивностью флуоресценции. С математической точки зрения построение изображений SOFI основывается на вычислении кумулянтов , для чего существуют два различных способа. Во-первых, изображение может быть рассчитано с помощью автокумулянтов ^[3], которые по определению полагаются только на информацию о каждом пикселе, а во-вторых, улучшенный метод использует информацию о разных пикселях посредством вычисления кросс-кумулянтов. ^[5] Оба метода могут значительно увеличить окончательное разрешение изображения, хотя расчет кумулянта имеет свои ограничения. Фактически SOFI может увеличивать разрешение во всех трех измерениях. ^[3]

Принцип [ править ]

Принцип вычисления автокумулянта SOFI (A) Схематическое изображение пиксельной сетки CCD, содержащей несколько сигналов излучателя (B) Вырезание двух флуорофоров с их сигналами, свёрнутыми с PSF системы, записанными в стеке изображений (C) Сигналы на каждом пикселе оцениваются с помощью кумулятивного вычисления (процесс, который можно понять с точки зрения корреляции и интегрирования).

Аналогично другим методам сверхвысокого разрешения SOFI основан на записи временного ряда изображения на камеру CCD или CMOS. В отличие от других методов регистрируемые временные ряды могут быть существенно короче, поскольку точная локализация излучателей не требуется, и поэтому допускается большее количество активированных флуорофоров на дифракционно-ограниченную область. Значения пикселей SOFI-изображения n-го порядка вычисляются из значений временного ряда пикселей в форме кумулянта n-го порядка, тогда как окончательное значение, присвоенное пикселю, можно представить как интеграл по корреляционная функция. Окончательно присвоенные значения интенсивности пикселей являются мерой яркости и корреляции сигнала флуоресценции. Математически nКумулянт -го порядка связан с корреляционной функцией n-го порядка, но обладает некоторыми преимуществами, касающимися результирующего разрешения изображения. Поскольку в SOFI разрешено несколько излучателей на DLA, подсчет фотонов в каждом пикселе является результатом наложения сигналов всех активированных соседних излучателей. Кумулянтный расчет теперь фильтрует сигнал и оставляет только сильно коррелированные колебания. Это обеспечивает усиление контраста и, следовательно, уменьшение фона для хорошей меры. Как видно из рисунка слева, распределение источников флуоресценции:

${\ displaystyle \ sum _ {k = 1} ^ {N} \ delta ({\ vec {r}} - {\ vec {r}} _ {k}) \ cdot \ varepsilon _ {k} \ cdot s_ { k} (t)}$

сворачивается с функцией рассеяния точки (PSF) U ( r ) системы. Следовательно, сигнал флуоресценции в момент времени t и положение определяется выражением${\ displaystyle {\ vec {r}}}$

${\ Displaystyle F ({\ vec {r}}, t) = \ sum _ {k = 1} ^ {N} U ({\ vec {r}} - {\ vec {r}} _ {k}) \ cdot \ varepsilon _ {k} \ cdot s_ {k} (t).}$

В приведенных выше уравнениях N - количество излучателей, расположенных в положениях с зависящей от времени молекулярной яркостью, где является переменной для постоянной молекулярной яркости и является зависимой от времени функцией флуктуаций. Молекулярная яркость - это просто средняя скорость счета флуоресценции, деленная на количество молекул в определенной области. Для упрощения следует предположить, что образец находится в стационарном равновесии, и поэтому сигнал флуоресценции может быть выражен как флуктуация с нулевым средним:${\ displaystyle {\ vec {r}} _ {k}}$${\ displaystyle \ varepsilon _ {k} \ cdot s_ {k}}$${\ displaystyle \ varepsilon _ {k}}$${\ displaystyle s_ {k} (t)}$

${\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=F({\vec {r}},t)-\langle F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}$

где обозначает усреднение по времени. Автокорреляция здесь, например, второго порядка, затем может быть дедуктивно описана следующим образом для определенного временного интервала :${\displaystyle \langle \cdots \rangle _{t}}$${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=\langle \delta F({\vec {r}},t+\tau )\cdot \delta F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}$

Из этих уравнений следует, что PSF оптической системы следует принимать в степени порядка корреляции. Таким образом, при корреляции второго порядка PSF будет уменьшена по всем измерениям в раз . В результате разрешение SOFI-изображений увеличивается в соответствии с этим фактором.${\displaystyle {\sqrt {2}}}$

Кумулянты против корреляций [ править ]

Использование только простой функции корреляции для переназначения значений пикселей приписало бы независимость флуктуаций излучателей во времени таким образом, что никакие члены взаимной корреляции не повлияли бы на новое значение пикселя. Вычисления корреляционных функций более высокого порядка будут страдать от корреляций более низкого порядка, по какой причине лучше вычислять кумулянты, поскольку все члены корреляции более низкого порядка исчезают.

Кумулянт-расчет [ править ]

Автокумулянты [ править ]

По вычислительным причинам удобно установить все временные запаздывания в кумулянтах высшего порядка равными нулю, чтобы можно было найти общее выражение для автокумулянта n-го порядка: ^[3]

${\displaystyle AC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\sum _{k=1}^{N}U^{n}({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\varepsilon _{k}^{n}w_{k}(0)}$

${\displaystyle w_{k}}$ - это взвешенная функция, основанная на конкретной корреляции, на которую влияет порядок кумулянта и в основном зависит от флуктуационных свойств излучателей.

Хотя нет никаких фундаментальных ограничений в вычислении очень высоких порядков кумулянтов и, таким образом, сокращении FWHM PSF, существуют практические ограничения в зависимости от взвешивания значений, присвоенных окончательному изображению. Эмиттеры с более высокой молекулярной яркостью будут демонстрировать сильное увеличение с точки зрения кумулянта пикселей, присвоенного более высоким порядкам, так же, как эту производительность можно ожидать из-за разнообразного появления флуктуаций разных излучателей. Таким образом, можно ожидать широкого диапазона яркости результирующего изображения, и в результате тусклые излучатели могут маскироваться яркими излучателями на изображениях более высокого порядка: ^{[3] [5]} Вычисление автокумулянтов может быть реализовано очень привлекательным способом в математическом смысле. пКумулянт -го порядка может быть вычислен с помощью базовой рекурсии по моментам ^[6]

${\displaystyle K_{n}({\vec {r}})=\mu _{n}({\vec {r}})-\sum _{i=1}^{n-1}{\begin{pmatrix}n-1\\i\end{pmatrix}}K_{n-i}({\vec {r}})\mu _{i}({\vec {r}})}$

где K - кумулянт порядка индекса, также представляет моменты. Термин в скобках означает биномиальный коэффициент. Этот способ вычисления более прост по сравнению с вычислением кумулянтов по стандартным формулам. Он позволяет вычислять кумулянты с минимальным временем вычислений и, поскольку он хорошо реализован, подходит даже для вычисления кумулянтов высокого порядка на больших изображениях.${\displaystyle \mu }$

Кросс-кумулянты [ править ]

Принципы расчета кросс-кумулянта SOFI и коэффициент расстояния: (A) Расчет кросс-кумулянта 4-го порядка с «комбинациями с повторениями». (B) Спад коэффициента расстояния по стрелкам.

В более продвинутом подходе кросс-кумулянты вычисляются с учетом информации нескольких пикселей. Кросс-кумулянты можно описать следующим образом: ^{[5] [7]}

${\displaystyle CC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\prod _{j<l}^{n}U{\Bigg (}{\frac {{\vec {r}}_{j}-{\vec {r}}_{l}}{\sqrt {n}}}{\Bigg )}\cdot \sum _{i=1}^{N}U^{n}{\Bigg (}{\vec {r}}_{i}-{\frac {\sum _{k}^{n}{\vec {r}}_{k}}{n}}{\Bigg )}\varepsilon _{i}^{n}w_{i}(0)}$

j , l и k - это индексы для участвующих пикселей, тогда как i - это индекс для текущей позиции. Все остальные значения и индексы используются по-прежнему. Основным отличием при сравнении этого уравнения с уравнением для автокумулянтов является появление весового коэффициента${\displaystyle U(r_{j}-r_{l}/{\sqrt {n}})}$. Этот весовой коэффициент (также называемый коэффициентом расстояния) имеет форму PSF и зависит от расстояния между взаимно коррелированными пикселями в том смысле, что вклад каждого пикселя уменьшается с увеличением расстояния в форме PSF. В принципе это означает, что коэффициент расстояния меньше для пикселей, которые находятся дальше друг от друга. Кросс-кумулянтный подход можно использовать для создания новых виртуальных пикселей, раскрывающих истинную информацию о меченом образце за счет уменьшения эффективного размера пикселя. Эти пиксели несут больше информации, чем пиксели, возникающие в результате простой интерполяции.

Кроме того, кросс-кумулянтный подход может использоваться для оценки PSF оптической системы путем использования разностей интенсивностей виртуальных пикселей, которые возникают из-за «потери» во взаимной корреляции, как упоминалось выше. ^[5] Каждый виртуальный пиксель может быть повторно взвешен с обратной величиной коэффициента расстояния пикселя, что приведет к восстановлению истинного кумулянтного значения. Наконец, PSF можно использовать для создания зависимости разрешения n для кумулянта n- го порядка путем повторного взвешивания «оптической передаточной функции» (OTF). ^[5] Этот шаг также можно заменить использованием PSF для деконволюции, что связано с меньшими вычислительными затратами.

Расчет кросс-кумулянта требует использования вычислительной гораздо более дорогой формулы, которая включает вычисление сумм по разделам. Это, конечно, связано с комбинацией разных пикселей для присвоения нового значения. Следовательно, на данном этапе нельзя использовать быстрый рекурсивный подход. Для расчета перекрестных кумулянтов можно использовать следующее уравнение: ^[8]

${\displaystyle K_{n}{\Bigg (}{\vec {r}}={\frac {1}{n}}\sum _{i=1}^{n}{\vec {r_{i}}}{\Bigg )}=\sum _{P}(-1)^{|P|-1}(|P|-1)!\prod _{p\in P}{\Big \langle }\prod _{i\in p}F({\vec {r}})_{i}{\Big \rangle }_{t}}$

В этом уравнении P обозначает количество возможных разделов, p обозначает различные части каждого раздела. Кроме того, i - это индекс для различных положений пикселей, учитываемый при вычислении, что для F- это просто стек изображений различных участвующих пикселей. Кросс-кумулянтный подход облегчает генерацию виртуальных пикселей в зависимости от порядка кумулянта, как упоминалось ранее. Эти виртуальные пиксели могут быть вычислены в конкретном шаблоне из исходных пикселей для перекрестно-кумулянтного изображения 4-го порядка, как это показано на нижнем изображении, часть A. Сам шаблон возникает просто из расчета всех возможных комбинаций Пиксели исходного изображения A, B, C и D. Здесь это было сделано по схеме «комбинации с повторениями». Виртуальные пиксели демонстрируют потерю интенсивности из-за самой корреляции. Часть B второго изображения отображает эту общую зависимость виртуальных пикселей от взаимной корреляции.Чтобы восстановить значимые значения пикселей, изображение сглаживается процедурой, которая определяет коэффициент расстояния для каждого пикселя виртуальной пиксельной сетки в форме PSF и применяет инверсию ко всем пикселям изображения, которые связаны с одним и тем же коэффициентом расстояния.^{[5] [7]}

Ссылки [ править ]