Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Количественная оценка вирусов включает подсчет количества вирусов в определенном объеме для определения концентрации вируса. Он используется как в научных исследованиях, так и в разработках (НИОКР) в коммерческих и академических лабораториях, а также в производственных ситуациях, когда количество вируса на различных этапах является важной переменной. Например, производство вирусных вакцин , рекомбинантных белков с использованием вирусных векторов и вирусных антигенов требует количественной оценки вируса для постоянной адаптации и мониторинга процесса с целью оптимизации производства и реагирования на постоянно меняющиеся потребности и области применения. Примеры конкретных случаев, когда необходимо количественно оценить известные вирусы, включают скрининг клонов,оптимизация множественности заражения (MOI) и адаптация методов к культуре клеток. На этой странице обсуждаются различные методы, используемые в настоящее время для количественного определения вирусов в жидких образцах. Эти методы делятся на две категории: традиционные и современные. Традиционные методы - это стандартные в отрасли методы, которые использовались десятилетиями, но, как правило, медленные и трудоемкие. Современные методы представляют собой относительно новые коммерчески доступные продукты и наборы, которые значительно сокращают время количественной оценки. Это не исчерпывающий обзор всех потенциальных методов, а скорее репрезентативное сечение традиционных методов и новых, коммерчески доступных методов. Хотя могут существовать и другие опубликованные методы количественной оценки вирусов, некоммерческие методы здесь не обсуждаются.

Традиционные методы [ править ]

Анализ зубного налета [ править ]

Вирусные бляшки вируса простого герпеса

Анализы на основе бляшек являются стандартным методом, используемым для определения концентрации вируса с точки зрения инфекционной дозы . Анализы вирусных бляшек определяют количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в образце вируса, что является одним из показателей количества вируса. Этот анализ основан на микробиологическом методе, проводимом в чашках Петри или многолуночных планшетах. В частности, конфлюэнтный монослой клеток- хозяев инфицирован вирусом при различных разведениях и покрывается полутвердой средой, такой как агар или карбоксиметилцеллюлоза., чтобы предотвратить беспорядочное распространение вирусной инфекции. Вирусная бляшка образуется, когда вирус заражает клетку внутри фиксированного монослоя клеток. [1] Клетка, инфицированная вирусом, будет лизировать и распространять инфекцию на соседние клетки, где цикл от заражения до лизиса повторяется. Зона инфицированных клеток образует бляшку (область инфекции, окруженную неинфицированными клетками), которую можно увидеть в оптический микроскоп или визуально (слить верхнюю среду и добавить раствор кристаллического фиолетового на 15 минут, пока он не окрасит цитоплазму. аккуратно удалив излишки воды, можно увидеть неокрашенные участки мертвых клеток [2]). Образование налета может занять 3–14 дней, в зависимости от анализируемого вируса. Бляшки обычно подсчитываются вручную, и результаты в сочетании с коэффициентом разбавления, используемым для приготовления планшета, используются для расчета количества бляшкообразующих единиц на единицу объема образца (БОЕ / мл). Результат БОЕ / мл представляет собой количество инфекционных частиц в образце и основан на предположении, что каждая образовавшаяся бляшка представляет одну инфекционную вирусную частицу. [3] [4]

Анализ формирования фокуса (FFA) [ править ]

Клетки, инфицированные ротавирусом (вверху) и неинфицированные клетки (внизу)

Анализ формирования фокуса (FFA) представляет собой разновидность анализа бляшек, но вместо того, чтобы полагаться на лизис клеток для обнаружения образования бляшек, FFA использует методы иммуноокрашивания с использованием флуоресцентно меченых антител, специфичных для вирусного антигена.для обнаружения инфицированных клеток-хозяев и инфекционных вирусных частиц до того, как образуется настоящий зубной налет. FFA особенно полезен для количественного определения классов вирусов, которые не лизируют клеточные мембраны, поскольку эти вирусы не поддаются анализу на бляшки. Подобно анализу бляшек, монослои клеток-хозяев инфицированы различными разведениями образца вируса и инкубируются в течение относительно короткого периода инкубации (например, 24-72 часа) в полутвердой наложенной среде, которая ограничивает распространение инфекционного вируса, создавая локальные скопления (очаги) инфицированных клеток. Затем планшеты исследуют флуоресцентно меченными антителами против вирусного антигена, и для подсчета и количественной оценки количества очагов используют флуоресцентную микроскопию.Метод FFA обычно дает результаты за меньшее время, чем доза зубного налета или 50-процентная инфекционная доза культуры ткани (TCID50 ), но он может быть более дорогим с точки зрения необходимых реагентов и оборудования. Время завершения анализа также зависит от размера области, которую считает пользователь. Большая площадь потребует больше времени, но может обеспечить более точное представление образца. Результаты FFA выражаются в единицах формирования фокуса на миллилитр или FFU / мл. [5]

Анализ конечного разведения [ править ]

Пятидесятипроцентная инфекционная доза культуры ткани (TCID 50 ) является мерой титра инфекционного вируса . Этот анализ конечного разведения позволяет количественно определить количество вируса, необходимое для уничтожения 50% инфицированных хозяев или для создания цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток тканевой культуры. Этот анализ может быть более распространен в клинических исследованиях, где необходимо определить летальную дозу вируса или если вирус не образует бляшек. При использовании в контексте культуры ткани клетки-хозяева высевают на чашки и добавляют серийные разведения вируса. После инкубации вручную наблюдают и записывают процент гибели клеток (т.е. инфицированных клеток) для каждого разведения вируса, а результаты используют для математического расчета результата TCID 50 .[5] [6] Из-за явных различий в методах и принципах анализа, TCID 50 и БОЕ / мл или другие результаты анализа на инфекционность не эквивалентны. Этот метод может занять до недели из-за времени инфицирования клеток. [7]

Два метода, обычно используемые для расчета TCID 50 (также могут использоваться для расчета других типов конечной точки 50%, таких как EC50 , IC50 и LD50 ):

  • Спирмен-Карбер [8]
  • Метод Рида-Мюнча

Теоретическое соотношение между TCID 50 и ОРПОМ составляет около 0,69 БОЯ = 1 TCID 50 на основе распределения Пуассона , [9] распределение вероятностейкоторый описывает, сколько случайных событий (вирусных частиц), происходящих с известной средней скоростью (титр вируса), вероятно, произойдет в фиксированном пространстве (количество вирусной среды в лунке). Однако необходимо подчеркнуть, что на практике эта взаимосвязь может не соблюдаться даже для одной и той же комбинации вирус + клетка, поскольку два типа анализа настроены по-разному, и инфекционность вируса очень чувствительна к различным факторам, таким как возраст клеток, наложенные среды, и т. д. Но следующая ссылка определяет взаимосвязь по-разному: предполагая, что используется одна и та же клеточная система, что вирус образует бляшки на этих клетках и что не добавляются никакие процедуры, которые ингибировали бы образование бляшек, ожидается, что 1 мл исходного вируса имеют примерно половину количества бляшкообразующих единиц (PFU), как TCID 50. Это всего лишь оценка, но она основана на том, что предельное разведение, которое могло бы инфицировать 50% зараженных слоев клеток, часто должно первоначально приводить к образованию единственной бляшки в инфицированных слоях клеток. В некоторых случаях случайно могут образоваться две или более бляшек, поэтому фактическое количество БОЕ следует определять экспериментально.

Математически ожидаемые PFU будут несколько больше, чем половина TCID 50 , поскольку отрицательные трубки в TCID 50 представляют собой блоки, образующие нулевой зубной налет, а каждая положительная трубка представляет собой один или несколько блоков формирования зубного налета. Более точная оценка получается применением распределения Пуассона. Где P (o) - доля отрицательных пробирок, а m - среднее количество инфекционных единиц в объеме (БОЕ / мл), P (o) = e (-m). Для любого титра, выраженного как TCID 50 , P (o) = 0,5. Таким образом, e (-m) = 0,5 и m = -ln 0,5, что составляет ~ 0,7.

Следовательно, можно умножить титр TCID 50 (на мл) на 0,7, чтобы предсказать среднее количество БОЕ / мл. При фактическом применении таких расчетов помните, что вычисленное среднее значение будет действительным только в том случае, если изменения в протоколе, необходимые для визуализации бляшек, не изменяют экспрессию инфекционного вируса по сравнению с экспрессией в условиях, используемых для TCID 50 .

Таким образом, в качестве рабочей оценки можно предположить, что материал с TCID 50, равным 1 × 10 5 TCID 50 / мл, будет производить 0,7 × 10 5 БОЕ / мл.

(от: ATCC - Преобразование TCID50 в блоки образования налета PFU-124 )

Протеиновые анализы [ править ]

Существует несколько вариантов количественного анализа вирусов на основе белков. Как правило, эти методы определяют количество либо всего белка, либо количество определенного вирусного белка в образце, а не количество инфицированных клеток или вирусных частиц. Количественная оценка чаще всего основана на флуоресценции.обнаружение. Некоторые варианты анализа позволяют количественно определять белок непосредственно в образце, в то время как другие варианты требуют инфицирования клетки-хозяина и инкубации для обеспечения роста вируса до количественного определения белка. Используемый вариант зависит в первую очередь от количества белка (например, вируса) в исходном образце и чувствительности самого анализа. Если требуется инкубация и рост вируса, перед анализом часто проводят лизис / расщепление клеток и / или вирусов. Большинство методов на основе белков относительно быстры и чувствительны, но требуют стандартов качества для точной калибровки и количественного определения белка, а не фактических концентраций вирусных частиц. Ниже приведены конкретные примеры широко используемых анализов на основе белков.

Анализ гемагглютинации [ править ]

Основная статья: Анализ гемагглютинации

Анализ гемагглютинации (НА) - это обычный нефлуоресцентный количественный анализ белков, специфичный для гриппа . Он основан на том факте, что гемагглютинин , поверхностный белок вирусов гриппа, агглютинирует эритроциты (то есть заставляет эритроциты слипаться). В этом анализе разведения образца вируса гриппа инкубируют с 1% раствором эритроцитов в течение одного часа и визуально определяют разведение вируса, при котором происходит первая агглютинация. Анализ дает результат в единицах гемагглютинации (HAU) с типичным соотношением БОЕ к HAU в диапазоне 10 6 . [10] [11] [12] Этот анализ занимает ~ 1-2 часа, а результаты могут сильно отличаться в зависимости от технических знаний оператора.

Анализ ингибирования гемагглютинации является распространенной разновидностью анализа HA, используемого для измерения уровней грипп-специфических антител в сыворотке крови. В этом варианте сывороточные антитела к вирусу гриппа будут препятствовать прикреплению вируса к эритроцитам. Следовательно, гемагглютинация подавляется, когда антитела присутствуют в достаточной концентрации. [13]

Анализ бицинхониновой кислоты [ править ]

Основная статья: Анализ бицинхониновой кислоты

Анализ бицинхониновой кислоты (BCA) основан на простом колориметрическом измерении и является наиболее распространенным методом количественного определения белка. BCA аналогичен анализам белка Лоури или Брэдфорда и впервые был коммерчески доступен компанией Pierce, которая в настоящее время принадлежит Thermo Fisher Scientific . В анализе BCA пептидные связи белка количественно восстанавливают Cu 2+ до Cu 1+ , что дает светло-голубой цвет. BCA хелатирует Cu 1+ в соотношении 2: 1, что приводит к более интенсивному окрашиванию частиц, которые поглощаются при 562 нм. Абсорбцияобразца при 562 нм используется для определения основной концентрации белка в образце. Результаты анализа сравнивают с известными стандартными кривыми после анализа с помощью спектрофотометра или планшет-ридера. [14] Общее время анализа составляет от 30 минут до одного часа. Хотя этот анализ является повсеместным и быстрым, ему не хватает специфичности, поскольку он учитывает весь белок, препарат вируса, подлежащий количественной оценке, должен содержать очень низкие уровни белков клетки-хозяина.

Однократный радиальный иммунодиффузионный анализ [ править ]

Анализ однократной радиальной иммунодиффузии (SRID), также известный как метод Манчини, представляет собой анализ белка, который определяет количество специфического вирусного антигена путем иммунодиффузии в полутвердой среде (например, агаре). Среда содержит антисыворотку, специфичную к интересующему антигену, и антиген помещен в центр диска. По мере того, как антиген диффундирует в среду, он создает кольцо осадка, которое растет до достижения равновесия. Время анализа может составлять от 10 часов до дней в зависимости от времени уравновешивания антигена и антитела. Диаметр зоны от кольца линейно связан с логарифмом концентрации белка и сравнивается с диаметрами зоны для известных стандартов белка для количественного определения. [15] Для этого анализа коммерчески доступны наборы и сыворотки (например, The Binding Site Inc.).

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) [ править ]

Тканевый срез новых вирионов H1N1

ПЭМ - это специализированный тип микроскопии, в котором для изображения образца используется пучок электронов, сфокусированный магнитным полем. ПЭМ обеспечивает визуализацию с пространственным разрешением в 1000 раз больше, чем световой микроскоп (разрешение до 0,2 нм). [16] Требуется ультратонкий образец с отрицательным окрашиванием . Приготовление образцов включает нанесение образцов на сетку ПЭМ с покрытием и отрицательное окрашивание электронно-непрозрачной жидкостью. [17] Образцы залитых тканей также могут быть исследованы при тонких срезах. Подготовка образцов различается в зависимости от протокола и пользователя, но обычно для завершения требуется несколько часов. Изображения ПЭМ могут показать отдельные вирусные частицы и количественный анализ изображенийможет использоваться для определения концентрации вируса. Эти изображения с высоким разрешением также предоставляют информацию о морфологии частиц, недоступную большинству других методов. Количественные результаты ТЕА часто будут выше, чем результаты других анализов, поскольку все частицы, независимо от инфекционности, количественно определены в сообщенном результате вирусоподобных частиц на мл (vlp / mL). Количественный ПЭМ обычно хорошо работает для концентраций вируса более 10 6 частиц / мл. Из-за высокой стоимости инструментов и необходимого количества места и вспомогательных средств оборудование ТЕА доступно в ограниченном количестве объектов.

Современные методы [ править ]

Настраиваемый резистивный импульсный датчик (TRPS) [ править ]

Основная статья: Настраиваемый резистивный датчик импульсов

Настраиваемое резистивное импульсное зондирование (TRPS) - это метод, который позволяет проводить высокопроизводительные измерения отдельных частиц отдельных вирусных частиц, поскольку они проходят через нанопоры настраиваемого размера , по одной за раз. [18] Этот метод имеет преимущество одновременного определения размера и концентрации вирусных частиц в растворе с высоким разрешением. Это можно использовать для оценки стабильности образца и вклада агрегатов, а также общей концентрации вирусных частиц (vp / мл). [19]

Измерение на основе TRPS происходит в ионном буфере, и предварительное окрашивание образцов перед анализом не требуется, поэтому этот метод является более быстрым, чем методы, требующие предварительной обработки флуоресцентными красителями, с общим временем подготовки и измерения менее 10 минут на образец. Анализ вирусов на основе TRPS коммерчески доступен через системы qViro-X , которые могут подвергаться химической дезинфекции путем автоклавирования после измерения.

Проточная цитометрия [ править ]

Хотя большинство проточных цитометров не обладают достаточной чувствительностью, существует несколько коммерчески доступных проточных цитометров, которые можно использовать для количественного определения вирусов. Счетчик вирусов количественно определяет количество интактных вирусных частиц в образце, используя флуоресценцию для обнаружения колокализованных белков и нуклеиновых кислот. Образцы окрашивают двумя красителями, один для белков, а другой для нуклеиновых кислот, и анализируют, когда они проходят через лазерный луч. Количество частиц, вызывающих одновременные события на каждом из двух отдельных каналов флуоресценции, определяется вместе с измеренной скоростью потока пробы для расчета концентрации вирусных частиц (vp / мл). [20] Результаты в целом аналогичны по абсолютной величине результату ПЭМ. Анализ имеет линейный рабочий диапазон 10 5 –109 vp / мл и время анализа ~ 10 мин с коротким временем подготовки образца.

Количественная полимеразная цепная реакция (КПЦР) [ править ]

Основная статья: Количественная ПЦР
Диаграмма ELISA

Количественная ПЦР использует химию полимеразной цепной реакции для амплификации вирусной ДНК или РНК для получения достаточно высоких концентраций для обнаружения и количественной оценки по флуоресценции. Как правило, количественная оценка с помощью qPCR основана на серийных разведениях стандартов известной концентрации, анализируемых параллельно с неизвестными образцами для калибровки и сравнения. Количественное обнаружение может быть достигнуто с использованием широкого спектра стратегий обнаружения флуоресценции, включая зонды, специфичные для последовательности, или неспецифические флуоресцентные красители, такие как SYBR Green . [21] Зонды, специфичные для последовательности, такие как TaqMan.(разработано Applied Biosystems), Molecular Beacons или Scorpion связываются только с ДНК соответствующей последовательности, образующейся во время реакции. Краситель SYBR Green связывается со всей двухцепочечной ДНК [22], образующейся в ходе реакции. Хотя SYBR Green прост в использовании, его недостаточная специфичность и низкая чувствительность заставляют большинство лабораторий использовать схемы обнаружения количественной ПЦР на основе зондов. Существует множество вариантов qPCR, включая метод сравнительного порога, который позволяет относительную количественную оценку путем сравнения значений Ct (циклы PCR, которые показывают статистически значимое увеличение продукта) из нескольких образцов, которые включают внутренний стандарт. [23] ПЦР амплифицирует всю нуклеиновую кислоту- мишень., в том числе происходящие из интактных инфекционных вирусных частиц, из дефектных вирусных частиц, а также из свободной нуклеиновой кислоты в растворе. Из-за этого результаты кПЦР (выраженные в количестве копий генома / мл), вероятно, будут выше по количеству, чем результаты ПЭМ. Для определения количества вирусов соотношение целых вирионов и копий нуклеиновой кислоты редко бывает один к одному. Это связано с тем, что во время репликации вируса нуклеиновая кислота и вирусные белки не всегда продуцируются в соотношении 1: 1, а процесс сборки вируса приводит к образованию полных вирионов, а также пустых капсидов и / или избыточных свободных вирусных геномов. В примере с вирусом ящура отношение целых вирионов к количеству копий РНК в активно реплицирующейся клетке-хозяине составляет приблизительно 1: 1000. [24]Продукты для титрования вирусов на основе количественной ПЦР коммерчески доступны через множество компаний (например, Invitrogen, Roche или Qiagen). Преимущества титрования методом qPCR включают быстрое время обработки (1–4 часа) и чувствительность (позволяет обнаруживать гораздо более низкую концентрацию вирусов, чем другие методы).

Иммуноферментный анализ (ИФА) [ править ]

ELISA - это более современный вариант анализа белка, в котором используются специфические антитела, связанные с ферментом, для обнаружения присутствия неизвестного количества антигена (например, вируса) в образце. Событие связывания антитело-антиген выявляется и / или количественно определяется по способности фермента преобразовывать реагент в обнаруживаемый сигнал, который можно использовать для расчета концентрации антигена в образце. [25] Пероксидаза хрена (HRP) - распространенный фермент, используемый в схемах ELISA из-за его способности усиливать сигнал и повышать чувствительность анализа. Существует множество разновидностей или типов анализов ELISA, но их обычно можно классифицировать как непрямые , конкурентные , сэндвич- тесты или обратные.. [26] Наборы для ELISA коммерчески доступны от множества компаний, и количественная оценка обычно проводится с помощью хромогенных репортеров или флуоресценции (например, Invitrogen, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Этот метод намного менее трудоемок, чем традиционные методы, и может занять от 4 до 24 часов в зависимости от времени инкубации антител.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Кауфманн, SH; Кабелиц, Д. (2002). Методы микробиологии Том 32: Иммунология инфекции . Академическая пресса . ISBN 0-12-521532-0.
  2. ^ Баер, Алан; Кен-Холл, Килен (4 ноября 2014 г.). «Определение концентрации вирусов с помощью анализов зубного налета: с использованием традиционных и новых систем наложения» . Журнал визуализированных экспериментов (93): e52065. DOI : 10.3791 / 52065 . PMC 4255882 . PMID 25407402 .  
  3. ^ Мартин, SJ (1978). Биохимия вирусов . Издательство Кембриджского университета . ISBN 0-12-402033-X.
  4. ↑ Якимович, Артур; Андриасян, Вардан; Витте, Роберт; Ван, И.-Сюань; Прасад, вибху; Суомалайнен, Маарит; Гребер, Урс Ф. (28 сентября 2015 г.). «Plaque2.0 - высокопроизводительная структура анализа для оценки передачи вирусных клеток и увеличения клональных клеток» . PLOS ONE . 10 (9): e0138760. Bibcode : 2015PLoSO..1038760Y . DOI : 10.1371 / journal.pone.0138760 . ISSN 1932-6203 . PMC 4587671 . PMID 26413745 .   
  5. ^ a b Флинт, SJ; Enquist, W .; Раканиелло, ВР; Скалка AM (2009). «Вирусологические методы». Принципы вирусологии . ASM Press. ISBN 978-1-55581-443-4.
  6. ^ Линденбах, Бретт Д. "Калькулятор Рида и Мюнха" .
  7. ^ «Архивная копия» (PDF) . Архивировано из оригинального (PDF) 27 сентября 2011 года . Проверено 26 февраля 2010 . CS1 maint: заархивированная копия как заголовок ( ссылка )
  8. ^ Karber, G. (1931). "Beitrag zur kollektiven Behandlung Pharmakologischer Reihenversuche". Архив ф. Экспериментируйте. Патол. U. Pharmakol . Springer-Verlag. 162 (4): 480–483. DOI : 10.1007 / BF01863914 . S2CID 46017573 . 
  9. ^ thneedle (16 апреля 2002 г.). «TCID50 и блок формирования зубного налета (PFU)» . Проверено 29 мая 2014 .
  10. Перейти ↑ Killian, ML (2008). «Анализ гемагглютинации вируса птичьего гриппа». В Spackman, Эрика (ред.). Вирус птичьего гриппа . 436 . Humana Press. С. 47–52. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-279-3_7 . ISBN 978-1-58829-939-0. PMID  18370040 .
  11. ^ Rimmelzwaan, GF; Baars, M .; Claas, ECJ; Остерхаус, ADME (1998). «Сравнение гибридизации РНК, анализа гемагглютинации, титрования инфекционного вируса и иммунофлуоресценции как методов мониторинга репликации вируса гриппа in vitro ». Журнал вирусологических методов . 74 (1): 57–66. DOI : 10.1016 / S0166-0934 (98) 00071-8 . PMID 9763129 . 
  12. ^ Като, А .; Киётани, К .; Sakai, Y .; Yoshida, T .; Нагай, Ю. (1997). «Парамиксовирус, вирус Сендай, V-белок кодирует роскошную функцию, необходимую для вирусного патогенеза» . Журнал EMBO . 16 (3): 578–587. DOI : 10.1093 / emboj / 16.3.578 . PMC 1169661 . PMID 9034340 .  
  13. ^ "Анализ ингибирования гемагглютинации гриппа" .
  14. ^ "Биология протеина Пирса" .
  15. ^ Родда, SJ; Галличио, штат Гавайи; Хэмпсон, AW (1981). «Анализ однократной радиальной иммунодиффузии выявляет небольшие антигенные различия между гемагглютининами вируса гриппа» . Журнал клинической микробиологии . 14 (5): 479–482. DOI : 10.1128 / JCM.14.5.479-482.1981 . PMC 273972 . PMID 6171580 .  
  16. ^ Шерман, I. "Разрешение электронного микроскопа" . Сборник фактов по физике . Проверено 25 февраля 2010 года .
  17. Перейти ↑ Steffens, WL (1998). "Использование просвечивающей электронной микроскопии для вирусной диагностики у птиц пситтацинов" . Материалы международных виртуальных конференций по ветеринарной медицине: болезни птиц-пситтацинов . Афины, Грузия.
  18. ^ Стивен Дж. Сауерби, Мюррей Ф. Брум, Джордж Б. Петерсен. «Динамически изменяемые апертуры нанометрового масштаба для молекулярного зондирования» Датчики и приводы B: Chemical Volume 123, Issue 1 (2007), страницы 325-330
  19. ^ Г. Сет Робертс, Сэм Ю, Цинлу Зенг, Лесли CL Чан, Уилл Андерсон, Аарон Х. Колби, Марк У. Гринстафф, Стивен Рид, Роберт Фогель. «Настраиваемые поры для измерения концентраций синтетических и биологических дисперсий наночастиц» Биосенсоры и биоэлектроника, 31 стр. 17-25, (2012).
  20. ^ Stoffel, CL; Finch, R .; Christensen, K .; Эдвардс, Д .; Роулен, KL (2005). «Быстрое определение титра бакуловирусов с помощью двухканального счетчика вирусов». Американская биотехнологическая лаборатория . 37 (22): 24–25.
  21. ^ «Протоколы ПЦР / ПЦР в реальном времени» .
  22. ^ «Прикладные биосистемы - США» (PDF) .
  23. ^ О'Лири, JJ; Sheils, O .; Martin, C .; Кроули, А. (2003). "Технология Taqman и полимеразная цепная реакция в реальном времени". В Crocker, J .; Мюррей, PG (ред.). Молекулярная биология в клеточной патологии . Джон Вили и сыновья . С. 251–268. ISBN 978-0-470-84475-5.
  24. ^ Каллахан Дж. Д. и др., Использование портативного анализа полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы в реальном времени для быстрого обнаружения вируса ящура. J Am Vet Med Assoc. 2002 июн 1; 220 (11): 1636-42.
  25. ^ Кемени, DM; Challacombe, SJ (1988). ELISA и другие твердофазные иммуноанализы: теоретические и практические аспекты . Джон Вили и сыновья . ISBN 0-471-90982-3.
  26. ^ Куби, J .; Киндт, TJ; Голдсби, РА; Осборн, BA (2007). Кубы Иммунология 6-е издание . WH Freeman and Company. ISBN 978-1-4292-0211-4.