В биохимии , иммунное любое использование антитела основанной методы для обнаружения конкретного белка в образце. Термин «иммуноокрашивание» первоначально использовался для обозначения иммуногистохимического окрашивания срезов ткани, как впервые было описано Альбертом Кунсом в 1941 году. [1] Однако теперь иммуноокрашивание охватывает широкий спектр методов, используемых в гистологии , клеточной биологии и молекулярной биологии. которые используют методы окрашивания на основе антител.
Методы [ править ]
Иммуногистохимия [ править ]
Иммуногистохимия или ИГХ-окрашивание срезов тканей (или иммуноцитохимия , которая представляет собой окрашивание клеток ), возможно, является наиболее часто применяемым методом иммуноокрашивания. [2] В то время как первые случаи IHC окрашивания использовали флуоресцентные красители (см иммунофлюоресценции ), другие не-флуоресцентные методы , использующие ферменты , такие как пероксидаза (см иммунопероксидазы окрашивания ) и щелочные фосфатазы в настоящее время используются. Эти ферменты способны катализировать реакции, в результате которых образуется окрашенный продукт, который легко обнаружить с помощью световой микроскопии . В качестве альтернативы,радиоактивные элементы можно использовать в качестве меток, а иммунореакцию можно визуализировать с помощью авторадиографии . [3]
Подготовка или фиксация ткани важны для сохранения морфологии клеток и архитектуры ткани. Неправильная или продолжительная фиксация может значительно снизить способность связывания антител. Многие антигены могут быть успешно продемонстрированы на срезах тканей, закрепленных формалином и парафином . Однако некоторые антигены не выдерживают даже умеренной фиксации альдегида. В этих условиях ткани следует быстро заморозить в жидком азоте и разрезать с помощью криостата. К недостаткам замороженных срезов можно отнести плохую морфологию, низкое разрешение при больших увеличениях, трудности с разрезанием парафиновых срезов и необходимость хранения в замороженном виде. Как вариант, вибратомСрезы не требуют обработки ткани органическими растворителями или высокой температурой, которые могут разрушить антигенность, или нарушением замораживания-оттаивания. Недостатком вибратомных секций является то, что процесс секционирования медленный и трудный для мягких и плохо закрепленных тканей, и что на секциях часто видны следы вибрации или линии вибратома.
Обнаружение многих антигенов может быть значительно улучшено с помощью методов поиска антигена, которые действуют путем разрушения некоторых перекрестных связей белков, образованных при фиксации, для обнаружения скрытых антигенных сайтов. Это может быть достигнуто путем нагревания в течение разного времени (извлечение эпитопа, индуцированного нагреванием или HIER) или с использованием ферментативного расщепления (извлечение эпитопа, индуцированного протеолитиками, или PIER). [4]
Одна из основных трудностей при окрашивании ИГХ - преодоление специфического или неспецифического фона. Оптимизация методов и времени фиксации, предварительная обработка блокирующими агентами, инкубация антител с высоким содержанием соли, а также оптимизация промывочных буферов после антител и времени промывки - все это важно для получения высококачественного иммуноокрашивания. Кроме того, для определения специфичности важно наличие положительного и отрицательного контролей для окрашивания.
Проточная цитометрия [ править ]
Цитометра поток может быть использован для прямого анализа клеток , экспрессирующих один или несколько специфических белков. Клетки иммуноокрашивают в растворе с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для иммунофлуоресценции, а затем анализируют проточной цитометрией.
Проточная цитометрия имеет несколько преимуществ перед ИГХ, включая: способность определять отдельные популяции клеток по их размеру и гранулярности; способность удалять мертвые клетки; повышенная чувствительность; и многоцветный анализ для одновременного измерения нескольких антигенов. Однако проточная цитометрия может быть менее эффективной при обнаружении чрезвычайно редких популяций клеток, и при отсутствии среза ткани происходит потеря архитектурных взаимоотношений. [5] Проточная цитометрия также связана с высокими капитальными затратами, связанными с покупкой проточного цитометра.
Вестерн-блоттинг [ править ]
Вестерн-блоттинг позволяет обнаруживать специфические белки из экстрактов, полученных из клеток или тканей, до или после любых этапов очистки . Белки обычно разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза перед переносом на синтетическую мембрану с помощью методов сухого, полусухого или влажного блоттинга. Затем мембрану можно исследовать с помощью антител, используя методы, аналогичные иммуногистохимии, но без необходимости фиксации. Обнаружение обычно выполняется с использованием антител, связанных с пероксидазой, для катализа хемилюминесцентной реакции.
Вестерн-блоттинг - это обычный метод молекулярной биологии, который можно использовать для полуколичественного сравнения уровней белка в экстрактах. Разделение по размеру перед блоттингом позволяет измерить молекулярную массу белка по сравнению с известными маркерами молекулярной массы.
Иммуноферментный анализ [ править ]
Иммуноферментный анализ или ELISA - это диагностический метод для количественного или полуколичественного определения концентраций белка в плазме крови , сыворотке или экстрактах клеток / тканей в формате многолуночного планшета (обычно 96 лунок на планшет). В целом белки в растворе адсорбируются на планшетах для ELISA. Антитела, специфичные к интересующему белку, используются для зондирования планшета. Фон сводится к минимуму за счет оптимизации методов блокирования и промывки (как для ИГХ), а специфичность обеспечивается за счет наличия положительных и отрицательных контролей. Методы обнаружения обычно основаны на колориметрии или хемилюминесценции.
Иммуно-электронная микроскопия [ править ]
Электронную микроскопию или ЭМ можно использовать для детального изучения микроархитектуры тканей или клеток. Иммуно-ЭМ позволяет обнаруживать специфические белки в ультратонких срезах тканей. Антитела, меченные частицами тяжелых металлов (например, золотом), можно непосредственно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии . Несмотря на то, что иммуно-ЭМ эффективен в обнаружении субклеточной локализации белка, он может быть технически сложным, дорогим и требовать строгой оптимизации методов фиксации и обработки ткани. Было предложено биотинилирование белков in vivo для облегчения проблем, вызванных частой несовместимостью окрашивания антител с протоколами фиксации, которые лучше сохраняют морфологию клеток. [6]
Методологический обзор [ править ]
В методах иммуноокрашивания антитело используется для обнаружения специфического белкового эпитопа . Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными . Обнаружение этого первого или первичного антитела можно осуществить несколькими способами.
- Первичное антитело можно непосредственно пометить с помощью фермента или флуорофора .
- Первичное антитело можно пометить с помощью небольшой молекулы, которая взаимодействует с партнером по связыванию с высоким сродством, который может быть связан с ферментом или флуорофором. Биотин - стрептавидин является одним широко используемым взаимодействием с высоким сродством.
- Первичное антитело можно исследовать на предмет использования более широкого видоспецифичного вторичного антитела , которое помечено с помощью фермента или флуорофора.
- В случае электронной микроскопии антитела связаны с частицами тяжелого металла (обычно с наночастицами золота диаметром 5-15 нм).
Как было описано ранее, ферменты , такими как хрена пероксидаза или щелочная фосфатаза обычно используется для катализа реакций , которые дают цветной или хемилюминесцентный продукт. Флуоресцентные молекулы можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной микроскопии .
Приложения [ править ]
Применения иммуноокрашивания многочисленны, но чаще всего они используются в клинической диагностике и лабораторных исследованиях .
Клинически ИГХ используется в гистопатологии для диагностики определенных типов рака на основе молекулярных маркеров.
В лабораторных исследованиях иммуноокрашивание можно использовать для различных целей, основанных на исследовании присутствия или отсутствия белка, его тканевого распределения, его субклеточной локализации, а также изменений в экспрессии или деградации белка.
См. Также [ править ]
- Кожные заболевания по данным иммунофлуоресценции
- Протокол иммуноокрашивания
- Список гистологических красителей, помогающих в диагностике кожных заболеваний
Ссылки [ править ]
- ^ Куна, Альберт; Creech HJ; Джонс, Р. Н. (1941). «Иммунологические свойства антитела, содержащего флуоресцентную группу». Proc Soc Exp Biol Med . 47 : 200–202.
- Перейти ↑ Ramos-Vara, JA (2005). «Технические аспекты иммуногистохимии». Vet Pathol . 42 (4): 405–426. DOI : 10.1354 / vp.42-4-405 . PMID 16006601 .
- ^ Введение в иммуногистохимию
- ^ AbD Serotec, Bio-Rad. «Совет IHC 1: получение антигена - что мне делать: PIER или HIER?» . Антитела Bio-Rad (ранее AbD Serotec) .
- Перейти ↑ Cherie, H (2004). «Применение проточной цитометрии и иммуногистохимии в диагностической гематопатологии». Архив патологии и лабораторной медицины . 128 (9): 1004–1022. DOI : 10,1043 / 1543-2165 (2004) 128 <1004: AOFCAI> 2.0.CO; 2 . PMID 15335254 .
- ^ Виенс, А .; Харпер, Ф .; Pichard, E .; Comisso, M .; Pierron, G .; Огрызко, В. (2008). «Использование биотинилирования белка in vivo для иммуноэлектронной микроскопической локализации конкретной изоформы белка» . Журнал гистохимии и цитохимии . 56 (10): 911–919. DOI : 10,1369 / jhc.2008.951624 . PMC 2544619 . PMID 18574249 .
