 | Эта статья требует внимания эксперта в области молекулярной и клеточной биологии . ( Февраль 2009 г. ) |
Иммуноцитохимия ( ICC ) - это распространенный лабораторный метод, который используется для анатомической визуализации локализации определенного белка или антигена в клетках с помощью специфического первичного антитела, которое с ним связывается. Первичное антитело позволяет визуализировать белок под флуоресцентным микроскопом, когда он связывается вторичным антителом , имеющим конъюгированный флуорофор . ICC позволяет исследователям оценить, экспрессируют ли клетки в конкретном образце рассматриваемый антиген [1] . В случаях, когда иммунопозитивныйсигнал обнаружен, ICC также позволяет исследователям определить, какие субклеточные компартменты экспрессируют антиген.
Иммуно цито химия против иммуно гисто химии [ править ]
Иммуноцитохимия отличается от иммуногистохимии [2] тем, что первая выполняется на образцах интактных клеток, у которых была удалена большая часть, если не весь, окружающий внеклеточный матрикс . [ необходима цитата ] Это включает отдельные клетки, которые были выделены из блока твердой ткани, клетки, выращенные в культуре , клетки, депонированные из суспензии , или клетки, взятые из мазка . Напротив, иммуногистохимические образцы представляют собой срезы биологической ткани., где каждая клетка окружена тканевой архитектурой и другими клетками, которые обычно находятся в неповрежденной ткани. Иммуноцитохимия - это метод, используемый для оценки присутствия определенного белка или антигена в клетках (культивируемых клетках, клеточных суспензиях) с помощью специфического антитела, которое связывается с ним, что позволяет визуализировать и исследовать под микроскопом. Это ценный инструмент для определения клеточного содержимого отдельных клеток. Образцы, которые можно проанализировать, включают мазки крови, аспираты, мазки, культивированные клетки и клеточные суспензии.
Есть много способов подготовить образцы клеток для иммуноцитохимического анализа. Каждый метод имеет свои сильные стороны и уникальные характеристики, поэтому можно выбрать правильный метод для желаемой выборки и результата.
Клетки, подлежащие окрашиванию, можно прикрепить к твердой подложке, чтобы облегчить использование в последующих процедурах. Этого можно добиться несколькими способами: прилипшие клетки можно выращивать на предметных стеклах микроскопа, покровных стеклах или на оптически подходящей пластиковой подложке. Суспензионные клетки можно центрифугировать на предметных стеклах ( цитоспин ), связать с твердой подложкой с помощью химических линкеров или, в некоторых случаях, обращаться с суспензией.
Концентрированные клеточные суспензии, существующие в среде с низкой вязкостью, являются хорошими кандидатами для приготовления мазков. Разбавленные суспензии клеток, существующие в разбавленной среде, лучше всего подходят для получения цитоспинов путем цитоцентрифугирования. Суспензии клеток, существующие в среде с высокой вязкостью, лучше всего подходят для тестирования в качестве препаратов мазков. Постоянным среди этих препаратов является то, что на поверхности предметного стекла присутствует вся клетка. Для того чтобы произошла какая-либо межклеточная реакция, иммуноглобулин должен сначала пройти через клеточную мембрану, которая не повреждена в этих препаратах. Реакции, происходящие в ядре, могут быть более сложными, а внеклеточные жидкости могут создавать уникальные препятствия для выполнения иммуноцитохимии. В этой ситуации,становится необходимым проницаемость клеток с использованием детергента (Triton X-100 или Tween-20) или выбора органических фиксаторов (ацетон, метанол или этанол).
Антитела являются важным инструментом для демонстрации как наличия, так и субклеточной локализации антигена. Окрашивание клеток - это очень универсальный метод, и, если антиген сильно локализован, он может обнаружить всего лишь тысячу молекул антигена в клетке. В некоторых случаях окрашивание клеток также может использоваться для определения приблизительной концентрации антигена, особенно с помощью анализатора изображений.
Методы [ править ]
Существует множество методов иммунологического обнаружения тканей, включая методы, непосредственно связанные с первичными антителами или антисыворотками. Прямой метод включает использование детектируемой метки (например, флуоресцентной молекулы, частиц золота и т. Д.) Непосредственно к антителу [3], которому затем позволяют связываться с антигеном (например, белком) в клетке.
Как вариант, существует множество косвенных методов . В одном из таких методов антиген связывается первичным антителом, которое затем амплифицируется с использованием вторичного антитела, которое связывается с первичным антителом. Затем применяется третичный реагент, содержащий ферментный фрагмент, который связывается со вторичным антителом. Когда применяется четвертичный реагент или субстрат, ферментативный конец третичного реагента превращает субстрат в продукт реакции пигмента, который дает цвет (возможны многие цвета; коричневый, черный, красный и т. Д.) В том же самом место, где исходное первичное антитело распознало интересующий антиген.
Некоторыми примерами используемых субстратов (также известных как хромогены) являются AEC (3-амино-9-этилкарбазол) или DAB ( 3,3'-диаминобензидин ). Использование одного из этих реагентов после воздействия необходимого фермента (например, пероксидазы хрена, конъюгированной с реагентом антител) дает положительный продукт иммунореакции. Иммуноцитохимическая визуализация конкретных представляющих интерес антигенов может использоваться, когда менее специфические пятна, такие как H&E (гематоксилин и эозин), не могут использоваться для постановки диагноза или для предоставления дополнительной прогностической информации относительно лечения (например, при некоторых формах рака).
Альтернативно вторичное антитело может быть ковалентно связано с флуорофором ( наиболее распространены FITC и родамин ), который обнаруживается с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. Местоположение флуоресценции будет варьироваться в зависимости от молекулы-мишени, внешнее для мембранных белков и внутреннее для цитоплазматических белков. Таким образом, иммунофлуоресценция является мощным методом в сочетании с конфокальной микроскопией для изучения локализации белков и динамических процессов ( экзоцитоз , эндоцитоз и т. Д.).
Ссылки [ править ]
- ^ В. Burry, Ричард (2010). Иммуноцитохимия . Спрингер, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. стр. 7 -16. ISBN 978-1-4419-1304-3.
- ^ Реншоу, Саймон (2017). Иммуногистохимия и иммуноцитохимия: основные методы, второе издание . John Wiley & Sons, Ltd., стр. 35–102.
- ^ Купер, Марк; Луммас, Шериден (2016). Иммуногистохимия и иммуноцитохимия: основные методы, второе издание . John Wiley & Sons, Ltd., стр. 21–23.
Внешние ссылки [ править ]
- Протокол иммуноцитохимического окрашивания
- Иммуногистохимия цельных эмбрионов мышей
