Изоляция клеток - это процесс отделения отдельных живых клеток от твердого блока ткани или клеточной суспензии. В то время как некоторые типы клеток естественным образом существуют в отдельной форме (например, клетки крови ), другие типы клеток, обнаруженные в твердой ткани, требуют специальных методов для разделения их на отдельные клетки. Это может быть выполнено с использованием ферментов для переваривания белков, которые связывают эти клетки вместе во внеклеточном матриксе . После переваривания матричных белков клетки остаются непрочно связанными друг с другом, но их можно аккуратно разделить механически. После изоляции на этих отдельных изолированных клетках можно проводить эксперименты, включаяэлектрофизиология зажима патч-клампа , визуализация флюоресценции кальция и иммуноцитохимия .
Методы
Циркулирующие клетки
Методы, необходимые для получения изолированных клеток, различаются в зависимости от требуемого типа клеток. Циркулирующие клетки, такие как клетки крови или некоторые опухолевые клетки, можно выделить, взяв образец крови. [1] Поскольку образцы крови содержат смесь многих разных типов клеток, необходимо использовать метод разделения клеток на разные типы. Наиболее часто используемый метод - проточная цитометрия, во время которой автоматический анализатор проверяет узкий поток клеток. В одной из версий этого метода поток клеток освещается светом, и анализатор обнаруживает отраженный свет или флуоресценцию перед использованием этой информации для быстрого перемещения интересующих клеток в камеру для сбора. [2]
Твердые ткани
При работе с твердыми тканями получение ткани для выделения клеток может быть более сложной задачей. Излишки ткани человека иногда можно получить во время запланированной операции, например, образцы ушка правого предсердия часто иссекают и выбрасывают во время операции на открытом сердце, такой как операция коронарного шунтирования . [3] Другие ткани, такие как образцы поджелудочной железы или мочевого пузыря, могут быть взяты для биопсии. В качестве альтернативы ткань животных часто получают путем умерщвления животного. [4]
После получения образца ткани его необходимо окружить или перфузировать раствором соответствующей температуры, содержащим соли и питательные вещества, необходимые для поддержания жизни клеток. Это может быть выполнено путем простого погружения ткани в раствор или может включать более сложные процедуры, такие как перфузия Лангендорфа . [3] Обычно используемые растворы включали модификации раствора Тирода или раствора Кребса и Хенселейта. Эти растворы содержат точные концентрации электролитов, включая натрий , калий , кальций , магний , фосфат , хлорид и глюкозу . Концентрации этих электролитов необходимо тщательно сбалансировать, обращая внимание на осмотическое давление. Кислотность раствора необходимо регулировать, часто используя буфер pH, такой как HEPES . Изоляция клеток из некоторых тканей может быть улучшена насыщением раствора кислородом. [3] На начальных этапах перфузия ткани раствором, не содержащим кальций, особенно полезна при изоляции сердечных миоцитов , поскольку отсутствие кальция вызывает разделение интеркалированных дисков . [5]
Затем к раствору можно добавить протеолитические ферменты . Ферменты, переваривающие коллаген ( коллагеназы ), часто используются при выделении клеток из сердца или мочевого пузыря. [3] [4] [6] Также можно использовать ферменты общего назначения, которые переваривают многие виды белков ( протеаз ). [3] При выделении клеток из ткани мозга могут потребоваться другие ферменты, расщепляющие ДНК (ДНКазы). [7]
Эти ферменты, помимо переваривания внеклеточного матрикса, также могут переваривать другие важные белки, необходимые для функционирования представляющих интерес клеток. Если клетки подвергаются воздействию этих ферментов слишком долго, это приводит к гибели клеток, но если они не подвергаются воздействию ферментов достаточно долго, переваривание внеклеточного матрикса не будет полным. После удаления ферментов из ткани путем перфузии ее вторым раствором, не содержащим ферментов, клетки можно механически отделить или диссоциировать. Простая техника диссоциации клеток включает разрезание ткани на небольшие кусочки перед перемешиванием кусочков в растворе с помощью пипетки. [3] [4]
Использует
Изолированные клетки можно использовать для изучения того, как клетки работают, как они изменяются в ответ на болезнь и как на них влияют лекарства. Примером экспериментальной техники, в которой используются изолированные клетки, является электрофизиология патч-зажима , используемая для изучения того, как заряженные частицы проходят через клеточную мембрану . Дополнительные методы включают визуализацию флуоресценции кальция с использованием красителей, которые излучают свет в ответ на кальций, чтобы измерить, как кальций регулируется в клетке, и иммуноцитохимию, которая использует антитела, помеченные флуоресцентным маркером, чтобы определить, где белки расположены внутри клетки. [8] Изолированные клетки также можно использовать для культивирования клеток , в котором одна клетка размножается с образованием колонии клеток. [4]
Выделение клеток также можно использовать как часть лечения. Выделение клеток островков поджелудочной железы с последующим их культивированием и трансплантацией использовалось для лечения пациентов с диабетом 1 типа . [9]
Смотрите также
- Сортировка ячеек
Рекомендации
- ^ Bhagwat N, Карпентер EL (2017). «Методы проточной цитометрии для выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Успехи экспериментальной медицины и биологии . 994 : 105–118. DOI : 10.1007 / 978-3-319-55947-6_5 . PMID 28560670 .
- ^ Ху П, Чжан В, Синь Х, Дэн Г (2016). «Выделение и анализ отдельных клеток» . Границы клеточной биологии и развития . 4 : 116. DOI : 10,3389 / fcell.2016.00116 . PMC 5078503 . PMID 27826548 .
- ^ а б в г д е Войт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток от крупных млекопитающих и человека» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98. DOI : 10.1016 / j.yjmcc.2015.07.006 . PMID 26186893 .
- ^ а б в г Лауч В.Е., Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288–98. DOI : 10.1016 / j.yjmcc.2011.06.012 . PMC 3164875 . PMID 21723873 .
- ^ Йейтс Дж. С., Дхалла Н. С. (февраль 1975 г.). «Структурные и функциональные изменения, связанные с отказом и восстановлением сердца после перфузии средой без Ca2 +». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 7 (2): 91–103. DOI : 10.1016 / 0022-2828 (75) 90011-5 . PMID 1121035 .
- ^ Kloskowski T, Uzarska M, Gurtowska N, Olkowska J, Joachimiak R, Bajek A, Gagat M, Grzanka A, Bodnar M, Marszałek A, Drewa T. (апрель 2014 г.). «Как выделить уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка . 27 (2): 85–93. DOI : 10.1007 / s13577-013-0070-у . PMID 24368576 .
- ^ Chew LJ, DeBoy CA, Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию» . Журнал методов неврологии . 236 : 125–47. DOI : 10.1016 / j.jneumeth.2014.08.017 . PMC 4171043 . PMID 25169049 .
- ^ Франк, Дж .; Бисальский, Гонконг; Dominici, S .; Помпелла, А. (январь 2000 г.). «Визуализация оксидантного стресса в тканях и изолированных клетках». Гистология и гистопатология . 15 (1): 173–184. DOI : 10.14670 / HH-15.173 . ISSN 0213-3911 . PMID 10668208 .
- ^ Киффер Т.Дж., Вольтьен К., Осафуне К., Ябе Д., Инагаки Н. (октябрь 2017 г.). «Стратегии замены бета-клеток при диабете» . Журнал исследований диабета . 9 : 457–463. DOI : 10.1111 / jdi.12758 . PMC 5934267 . PMID 28984038 .
дальнейшее чтение
- Выделение кардиомиоцитов предсердий: Войт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток от крупных млекопитающих и человека» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 86 : 187–98. DOI : 10.1016 / j.yjmcc.2015.07.006 . PMID 26186893 .
- Выделение кардиомиоцитов желудочков: Лауч В.Е., Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов» . Журнал молекулярной и клеточной кардиологии . 51 (3): 288–98. DOI : 10.1016 / j.yjmcc.2011.06.012 . PMC 3164875 . PMID 21723873 .
- Выделение островковых клеток поджелудочной железы: Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olack BJ, Scharp DW (апрель 1988 г.). «Автоматизированный метод выделения островков поджелудочной железы человека». Диабет . 37 (4): 413–20. DOI : 10.2337 / diab.37.4.413 . PMID 3288530 .
- Выделение гемопоэтических стволовых клеток: Ректор К., Лю Й., Ван Зант Г. (2013). «Комплексные методы выделения гемопоэтических стволовых клеток». Методы молекулярной биологии . 976 : 1–15. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-317-6_1 . PMID 23400430 .
- Выделение мезенхимальных стволовых клеток: Йосупов Н, Хаимов Х, Юодзбалыс Г (2017). «Мобилизация, выделение и характеристика стволовых клеток периферической крови: систематический обзор» . Журнал оральных и челюстно-лицевых исследований . 8 (1): e1. DOI : 10,5037 / jomr.2017.8101 . PMC 5423306 . PMID 28496961 .
- Выделение звездчатых клеток печени: Шан Л., Хоссейни М., Лю Х, Киселева Т., Бреннер Д.А. (январь 2018 г.). «Выделение и характеристика звездчатых клеток печени человека» . Журнал гастроэнтерологии . 53 (1): 6–17. DOI : 10.1007 / s00535-017-1404-4 . PMID 29094206 .
- Выделение циркулирующих опухолевых клеток: Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Методы проточной цитометрии для выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Успехи экспериментальной медицины и биологии . 994 : 105–118. DOI : 10.1007 / 978-3-319-55947-6_5 . PMID 28560670 .
- Выделение нейроглиальных клеток: Chew LJ, DeBoy CA, Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию» . Журнал методов неврологии . 236 : 125–47. DOI : 10.1016 / j.jneumeth.2014.08.017 . PMC 4171043 . PMID 25169049 .
- Выделение уротелиальных клеток: Kloskowski T, Uzarska M, Gurtowska N, Olkowska J, Joachimiak R, Bajek A, Gagat M, Grzanka A, Bodnar M, Marszałek A, Drewa T. (апрель 2014 г.). «Как выделить уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка . 27 (2): 85–93. DOI : 10.1007 / s13577-013-0070-у . PMID 24368576 .