Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Система визуализации с изображением широкоугольного многофотонного микроскопа [1]

Многофотонная микроскопия с широким полем [2] [3] [4] [5] относится к методу оптического нелинейного изображения, предназначенному для сверхбыстрой визуализации, при котором большая область объекта освещается и отображается без необходимости сканирования. Высокая интенсивность требуется, чтобы вызвать нелинейные оптические процессы, такие как двухфотонная флуоресценция или генерация второй гармоники . В сканирующих многофотонных микроскопах высокая интенсивность достигается за счет сильной фокусировки света, а изображение получается путем сканирования луча. В широкоугольной многофотонной микроскопии высокие интенсивности лучше всего достигаются при использовании оптически усиленногоимпульсный лазерный источник для достижения большого поля зрения (~ 100 мкм). [2] [3] [4] Изображение в этом случае получается в виде одного кадра с помощью ПЗС без необходимости сканирования, что делает этот метод особенно полезным для визуализации динамических процессов одновременно на интересующем объекте. С помощью широкоугольной многофотонной микроскопии частота кадров может быть увеличена до 1000 раз по сравнению с многофотонной сканирующей микроскопией . [3] Многофотонные микроскопы с широким полем поля еще не поступили в продажу, но рабочие прототипы существуют в нескольких оптических лабораториях.

Введение [ править ]

Основная характеристика методики - освещение широкой площади образца импульсным лазерным лучом. В нелинейной оптике количество нелинейных фотонов (N), генерируемых импульсным лучом на (освещающую) площадь в секунду, пропорционально [6] [7]

,

где E - энергия луча в джоулях, τ - длительность импульса в секундах, A - площадь освещения в квадратных метрах, а f - частота повторения импульсного луча в герцах. Таким образом, увеличение площади освещения уменьшает количество генерируемых нелинейных фотонов, если только энергия не увеличивается. Оптическое повреждение зависит от плотности энергии, т. Е. Пиковой интенсивности на площади I p.= E / (τA). Следовательно, и площадь, и энергия могут быть легко увеличены без риска оптического повреждения, если пиковая интенсивность на площадь остается низкой, и все же может быть получен выигрыш в количестве генерируемых нелинейных фотонов из-за квадратичной зависимости. Например, при увеличении площади и энергии в 1000 раз интенсивность пика остается неизменной, но генерируемые нелинейные фотоны увеличиваются в 1000 раз. Эти 1000 дополнительных фотонов действительно генерируются на большей площади. При визуализации это означает, что лишние 1000 фотонов распределяются по изображению, что на первый взгляд может не показаться преимуществом перед многофотонной сканирующей микроскопией. Однако преимущество становится очевидным, если учесть размер изображения и время сканирования. [3]Количество нелинейных фотонов на кадр изображения в секунду, генерируемых широкопольным многофотонным микроскопом по сравнению со сканирующим многофотонным микроскопом, определяется выражением [3]

,

если предположить, что в обеих системах используется одинаковая пиковая интенсивность. Здесь n - количество таких точек сканирования, что .

Ограничения [ править ]

  • Этот метод не подходит для получения изображений глубоко в рассеивающей ткани (например, в головном мозге), поскольку качество изображения быстро ухудшается с увеличением глубины.
  • Предел, до которого можно увеличить энергию, зависит от лазерной системы. Оптические усилители, такие как регенеративный усилитель , обычно могут давать энергию до мДж с более низкой частотой повторения по сравнению с системами на основе генераторов (например, Ti: сапфировый лазер ).
  • Возможно повреждение оптики, если луч каким-то образом сфокусирован где-то в оптической системе на небольшую площадь. Существуют различные методы достижения необходимого освещения без риска повреждения оптики (см. Методы).
  • Поперечное сечение по глубине может отсутствовать.

Преимущества [ править ]

  • Сверхбыстрая визуализация. Для получения одного изображения требуется один лазерный выстрел. Таким образом, частота кадров ограничена частотой повторения лазерной системы или частотой кадров CCD-камеры.
  • Меньшее повреждение клеток. В водных системах (таких как клетки) частота повторения от средней до низкой (1–200 кГц) допускает тепловую диффузию между импульсами освещения, так что порог повреждения выше, чем при высокой частоте повторения (80 МГц). [8] [9]
  • Весь объект можно наблюдать одновременно благодаря широкопольному освещению.
  • Большая глубина проникновения в биологической визуализации по сравнению с однофотонной флуоресценцией из-за требуемых более длинных волн.
  • Более высокое разрешение, чем у широкоугольной однофотонной флуоресцентной микроскопии. Оптическое разрешение может быть сопоставимо или лучше, чем у многофотонных сканирующих микроскопов [].

Методы [ править ]

Существует техническая сложность достижения большой площади освещения без разрушения оптики формирования изображения. Одним из подходов является так называемая пространственно-временная фокусировка [4] [5], при которой импульсный луч пространственно рассеивается дифракционной решеткой, формирующей «радужный» луч, который затем фокусируется линзой объектива. [5] Эффект фокусировки «радужного» луча при отображении дифракционной решетки заставляет разные длины волн перекрываться в фокальной плоскости линзы объектива. Тогда разные длины волн мешают только в перекрывающемся объеме, если не вводится дополнительная пространственная или временная дисперсия, так что интенсивное импульсное освещение восстанавливается и способно давать изображения с поперечными сечениями. Осевое разрешение обычно составляет 2-3 мкм [4].[5] даже с использованием методов структурированного освещения. [10] [11] Пространственная дисперсия, создаваемая дифракционной решеткой, гарантирует, что энергия в лазере распространяется на более широкую площадь линзы объектива, что снижает вероятность повреждения самой линзы.

В отличие от того, что предполагалось изначально, временная фокусировка замечательно устойчива к рассеянию. [12] Его способность проникать через мутную среду с минимальным количеством спеклов была использована в оптогенетике , что позволило фотовозбуждению произвольных световых узоров через ткань. [12] Временная фокусировка позже была объединена с однопиксельным детектированием, чтобы преодолеть эффект рассеяния на флуоресцентных фотонах. [13] Этот метод, получивший название TRAFIX , позволял получать изображения в широком поле биологических тканей на больших глубинах с более высоким отношением сигнал / фон и меньшим фотообесцвечиванием, чем при стандартной точечной двухфотонной микроскопии . [13]

Другой более простой метод состоит из двух пучков, которые слабо сфокусированы и накладываются на область (~ 100 мкм) на образце. [2] [3] С помощью этого метода можно получить доступ ко всем элементам тензора благодаря возможности изменять поляризацию каждого луча независимо.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Масиас-Ромеро, Карлос; Дидье, Мари EP; Журден, Паскаль; Марке, Пьер; Магистретти, Пьер; Tarun, Orly B .; Зубковы, Виталий; Раденович, Александра ; Рок, Сильви (15 декабря 2014). «Высокопроизводительная визуализация второй гармоники для биологических приложений без этикеток» (PDF) . Оптика Экспресс . 22 (25): 31102–12. DOI : 10.1364 / oe.22.031102 . ISSN  1094-4087 . PMID  25607059 .
  2. ^ a b c Петерсон, Марк Д .; Хейс, Патрик Л .; Мартинес, Ими Су; Cass, Laura C .; Ахтил, Дженнифер Л .; Вайс, Эмили А .; Гейгер, Франц М. (01.05.2011). «Формирование изображения генерации второй гармоники с усилителем кГц [Приглашено]». Оптические материалы Экспресс . 1 (1): 57. DOI : 10,1364 / ome.1.000057 .
  3. ^ a b c d e f Масиас-Ромеро, Карлос; Дидье, Мари EP; Журден, Паскаль; Марке, Пьер; Магистретти, Пьер; Tarun, Orly B .; Зубковы, Виталий; Раденович, Александра ; Рок, Сильви (15 декабря 2014). «Высокопроизводительная визуализация второй гармоники для биологических приложений без этикеток» (PDF) . Оптика Экспресс . 22 (25): 31102. DOI : 10,1364 / oe.22.031102 . PMID 25607059 .  
  4. ^ a b c d Ченг, Ли-Чунг; Чанг, Цзя-Юань; Линь, Чун-Ю; Чо, Кенг-Чи; Йен, Вэй-Чунг; Чанг, Наньшань; Сюй, Крис; Дун, Чэнь Юань; Чен, Шин-Джен (2012-04-09). «Широкопольная многофотонная микроскопия на основе пространственно-временной фокусировки для быстрого оптического сечения» . Оптика Экспресс . 20 (8): 8939–48. DOI : 10.1364 / oe.20.008939 . PMID 22513605 . 
  5. ^ a b c d Орон, Дэн; Тал, Эран; Зильберберг, Ярон (2005-03-07). «Безсканирующая микроскопия с глубинным разрешением» . Оптика Экспресс . 13 (5): 1468–76. DOI : 10.1364 / opex.13.001468 . PMID 19495022 . 
  6. ^ Shen, YR (1989-02-09). «Свойства поверхности, исследованные с помощью генерации второй гармоники и суммарной частоты» . Природа . 337 (6207): 519–525. DOI : 10.1038 / 337519a0 . S2CID 4233043 . 
  7. ^ Дадап, JI; Hu, XF; Russell, M .; Ekerdt, JG; Лоуэлл, Дж. К.; Даунер, MC (1995-12-01). «Анализ генерации второй гармоники с помощью неусиленных ультракоротких лазерных импульсов с высокой частотой повторения на границах раздела Si (001)». IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics . 1 (4): 1145–1155. DOI : 10.1109 / 2944.488693 . ISSN 1077-260X . 
  8. ^ Macias-Romero, C .; Зубковы, В .; Wang, S .; Роке, С. (01.04.2016). «Широкопольная многофотонная микроскопия со средней частотой повторения уменьшает фотоповреждение живых клеток» . Биомедицинская оптика Экспресс . 7 (4): 1458–1467. DOI : 10,1364 / boe.7.001458 . ISSN 2156-7085 . PMC 4929654 . PMID 27446668 .   
  9. ^ Harzic, R. Le; Riemann, I .; König, K .; Wüllner, C .; Деницкий, К. (2007-12-01). «Влияние облучения фемтосекундным лазерным импульсом на жизнеспособность клеток при 1035, 517 и 345 нм». Журнал прикладной физики . 102 (11): 114701. DOI : 10,1063 / 1,2818107 . ISSN 0021-8979 . 
  10. ^ Choi, Heejin; Ю, Элайджа Ю.С.; Халлакоглу, Бертан; Фантини, Серджио; Шеппард, Колин-младший; Итак, Питер ТК (01.07.2013). «Улучшение осевого разрешения и контраста в широкоугольной двухфотонной микроскопии с временной фокусировкой и структурированным световым освещением» . Биомедицинская оптика Экспресс . 4 (7): 995–1005. DOI : 10,1364 / boe.4.000995 . PMC 3704103 . PMID 23847726 .  
  11. ↑ Yew, Elijah YS; Чой, Хиджин; Ким, Дэкеун; Итак, Питер ТК (01.01.2011). «Широкопольная двухфотонная микроскопия с временной фокусировкой и подавлением фона HiLo». В Периасамии - Аммаси; Кениг, Карстен; Итак, Питер Т. С. (ред.). Многофотонная микроскопия в биомедицинских науках XI . 7903 . С. 79031O – 79031O – 6. DOI : 10.1117 / 12.876068 . hdl : 1721,1 / 120979 . S2CID 120466973 . 
  12. ^ a b Papagiakoumou, Eirini; Бег, Орельен; Лешем, Бен; Шварц, Осип; Стелл, Брэндон М .; Брэдли, Джонатан; Орон, Дэн; Эмилиани, Валентина (17.02.2013). «Функциональное структурированное многофотонное возбуждение глубоко внутри рассеивающей ткани» (PDF) . Природа Фотоника . 7 (4): 274–278. DOI : 10.1038 / nphoton.2013.9 . ISSN 1749-4885 .  
  13. ^ а б Эскобет-Монтальбан, Адриа; Спесывцев, Роман; Чен, Минчжоу; Сабер, Вардия Афшар; Эндрюс, Мелисса; Херрингтон, К. Саймон; Мазилу, Михаил; Дхолакия, Кишан (2018-10-01). «Широкопольное многофотонное изображение через рассеивающую среду без коррекции» . Наука продвигается . 4 (10): eaau1338. arXiv : 1712.07415 . DOI : 10.1126 / sciadv.aau1338 . ISSN 2375-2548 . PMC 6184782 . PMID 30333995 .