Осаждение сульфатом аммония - один из наиболее часто используемых методов крупномасштабной и лабораторной очистки и фракционирования белков, который можно использовать для разделения белков путем изменения их растворимости в присутствии высокой концентрации соли.
Характеристики
Сульфат аммония - это неорганическая соль с высокой растворимостью, которая диссоциирует на аммоний (NH 4 + ) и сульфат (SO 4 2- ) в водных растворах. [1] Сульфат аммония особенно полезен в качестве осадителя, поскольку он хорошо растворим, стабилизирует структуру белка, имеет относительно низкую плотность, легко доступен и относительно недорого.
Механизм
Сульфат аммония, как и другие нейтральные соли, стабилизирует белки путем предпочтительной сольватации . Белки обычно хранятся в сульфате аммония, потому что он подавляет рост бактерий. С добавлением сульфата аммония белки, развернутые денатурантами, могут быть переведены в их естественные конформации. Это можно увидеть по сворачиванию рекомбинантных белков. [2]
Растворимость белков зависит от ионной силы раствора, то есть от концентрации соли. При низких концентрациях ионов (<0,5 М) растворимость белков увеличивается с увеличением концентрации соли, эффект, называемый « засаливанием ». По мере дальнейшего увеличения концентрации соли растворимость белка начинает снижаться. При достаточно высокой ионной силе белок будет выпадать в осадок из раствора, что называется « высаливанием ». [3] Когда ионы аммония (NH 4 + ) и сульфата (SO 4 2- ) находятся в водном растворе, они притягиваются к противоположным зарядам, очевидным на очищаемом соединении. Это притяжение противоположных зарядов предотвращает взаимодействие молекул воды с очищаемым соединением, что приводит к осаждению или «высаливанию». [2]
Белки заметно различаются по своей растворимости при высокой ионной силе, поэтому «высаливание» является очень полезной процедурой, способствующей очистке желаемого белка. Сульфат аммония обычно используется для осаждения из-за его высокой растворимости, кроме того, он образует два иона с высоким содержанием в ряду Хофмайстера . Поскольку эти два иона находятся в конце ряда Хофмайстера, сульфат аммония также может стабилизировать структуру белка. [3] Характеристика растворимости сульфата аммония для белка обычно выражается как функция процента насыщения. Кривая растворимости может быть определена путем построения логарифма экспериментально определенной растворимости, выраженной в мг / мл, в зависимости от процентного насыщения сульфата аммония. [4]
При механизме высаливания происходит выпадение соли из слоя воды, который тесно связан с поверхностью белка, известного как гидратный слой. Слой гидратации играет жизненно важную роль в поддержании растворимости и подходящей естественной конформации. Существует три основных взаимодействия белка с водой: гидратация ионов между заряженными боковыми цепями, водородная связь между полярными группами и водой и гидрофобная гидратация. После добавления соли в смесь увеличивается поверхностное натяжение воды, что увеличивает гидрофобные взаимодействия между водой и интересующим белком. Затем интересующий белок уменьшает свою площадь поверхности, что уменьшает его контакт с растворителем. Об этом свидетельствует сворачивание и самоассоциация, что в конечном итоге приводит к выпадению осадков. Сворачивание и самоассоциация белка выталкивает свободную воду, что приводит к увеличению энтропии и делает этот процесс энергетически выгодным. [2]
Процедура
Обычно концентрацию сульфата аммония повышают ступенчато, и осажденный белок извлекают на каждой стадии. Обычно это делается путем добавления твердого сульфата аммония; однако расчет количества сульфата аммония, которое необходимо добавить в раствор для достижения желаемой концентрации, может быть затруднительным, поскольку добавление сульфата аммония значительно увеличивает объем раствора. Количество сульфата аммония, которое следует добавить в раствор, можно определить по опубликованным номограммам или с помощью онлайн-калькулятора. [5] Прямое добавление твердого сульфата аммония изменяет pH раствора, что может привести к потере активности фермента. [6] В этих случаях добавление насыщенного сульфата аммония в подходящий буфер используется в качестве альтернативы добавлению твердого сульфата аммония. При любом подходе полученный осадок белка может быть растворен индивидуально в стандартном буфере и проанализирован для определения общего содержания белка.
Добавляемая концентрация сульфата аммония должна быть увеличена до значения, при котором будет осаждаться большая часть представляющего интерес белка, при этом максимальное количество белковых примесей все еще остается в растворе. Представляющий интерес осажденный белок может быть впоследствии извлечен центрифугированием и растворен в стандартном буфере, чтобы подготовить образец для следующей стадии очистки.
На следующем этапе очистки всю эту добавленную соль нужно удалить из белка. Один из способов сделать это - использовать диализ, но диализ еще больше разбавляет концентрированный белок. Лучшим способом удаления сульфата аммония из белка является смешивание осадка белка в буфере, содержащем смесь SDS, трис-HCl и фенола, и центрифугирование смеси. Осадок, полученный после центрифугирования, будет содержать бессолевой концентрированный белок. [7]
Приложения
Осаждение сульфатом аммония - полезный метод в качестве начального этапа очистки белка, поскольку он обеспечивает быстрое массовое осаждение клеточных белков. [4] Его также часто используют на более поздних стадиях очистки для концентрирования белка из разбавленного раствора после таких процедур, как гель-фильтрация . Недостатком этого метода является то, что часто вместе с белком могут осаждаться различные вещества, и необходимо применять другие методы очистки, такие как ионная хроматография или эксклюзионная хроматография . [3]
Рекомендации
- ^ «Сульфат аммония» . PubChem . Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США . Проверено 5 мая 2017 .
- ^ а б в Вингфилд П. (май 2001 г.). «Осаждение белков сульфатом аммония» . Текущие протоколы в науке о белке . Приложение 3 (1): A.3F.1 – A.3F.8. DOI : 10.1002 / 0471140864.psa03fs13 . ISBN 0471140864. PMC 4817497 . PMID 18429073 .
- ^ а б в Duong-Ly KC, Gabelli SB (2014). «Высаливание белков осаждением сульфатом аммония». Методы в энзимологии . 541 : 85–94. DOI : 10.1016 / B978-0-12-420119-4.00007-0 . ISBN 9780124201194. PMID 24674064 .
- ^ а б Берджесс Р.Р. (2009). «Методы осаждения белков». Методы в энзимологии . 463 : 331–42. DOI : 10.1016 / S0076-6879 (09) 63020-2 . PMID 19892180 .
- ^ «Калькулятор сульфата аммония» . EnCor Biotechnology Inc . Проверено 19 апреля 2013 года .
- ^ «[7a] Синтаза жирных кислот из куриной печени» . ScienceDirect . 1975-01-01. С. 59–65. DOI : 10.1016 / 0076-6879 (75) 35138-0 . ISSN 0076-6879 . Проверено 31 октября 2020 .
- ^ Ван В., Лю QJ, Цуй Х. (июль 2007 г.). «Быстрое обессоливание и восстановление белка фенолом после фракционирования сульфатом аммония». Электрофорез . 28 (14): 2358–60. DOI : 10.1002 / elps.200600743 . PMID 17577882 . S2CID 33402573 .