Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Стандартные визуальные символы Synthetic Biology Open Language (SBOL) для использования с BioBricks Standard

Части BioBrick - это последовательности ДНК, соответствующие стандарту сборки рестрикционных ферментов . [1] [2] Эти строительные блоки используются для разработки и сборки более крупных синтетических биологических схем из отдельных частей и комбинаций частей с определенными функциями, которые затем будут включены в живые клетки, такие как клетки Escherichia coli, для создания новых биологических систем. [3] Примеры частей BioBrick включают промоторы , сайты связывания рибосом (RBS) , кодирующие последовательности и терминаторы .

Обзор [ править ]

Иерархия абстракций позволяет разбить сложность.

Части BioBrick используются с применением инженерных принципов абстракции и модульности. Части BioBrick образуют основу иерархической системы, на которой основана синтетическая биология . В иерархии есть три уровня:

  1. Части: фрагменты ДНК, которые образуют функциональную единицу (например, промотор, RBS и т. Д.)
  2. Устройство: комплект деталей с определенной функцией. Проще говоря, набор дополнительных частей BioBrick, собранных вместе, образует устройство.
  3. Система: комбинация набора устройств, выполняющая задачи высокого уровня.

Разработка стандартизированных биологических частей позволяет быстро собрать последовательности. Возможность тестировать отдельные части и устройства, подлежащие независимому тестированию и характеризации, также повышает надежность систем более высокого порядка. [4]

История [ править ]

Первая попытка составить список стандартных биологических частей была предпринята в 1996 году Ребачуком и соавт . Эта команда представила стратегию клонирования для сборки коротких фрагментов ДНК. Однако в то время эта ранняя попытка не получила широкого признания в научном сообществе. [2] [5] В 1999 году Аркин и Энди поняли, что гетерогенным элементам, составляющим генетическую цепь, не хватает стандартов, поэтому они предложили список стандартных биологических частей. [6] BioBricks были описаны и представлены Томом Найтом в Массачусетском технологическом институте в 2003 году. С тех пор различные исследовательские группы использовали стандартные детали BioBrick для создания новых биологических устройств и систем.

Фонд BioBricks [ править ]

Фонд BioBricks Foundation был основан в 2006 году инженерами и учеными как некоммерческая организация для стандартизации биологических компонентов во всех областях. [7] Фонд фокусируется на улучшении в областях технологий, права, образования и глобального сообщества, поскольку они применяются к синтетической биологии . Деятельность BioBricks Foundation включает проведение конференций SBx.0, технических и образовательных программ. Конференции SBx.0 - это международные конференции по синтетической биологии, проводимые по всему миру. Технические программы нацелены на производство ряда стандартных биологических частей, и их расширение обучения направлено на создание актов, которые помогают создавать открытые стандартизованные источники биологических частей. [8]

Публичное соглашение BioBricks [ править ]

В качестве альтернативы традиционным биотехнологическим патентным системам и в попытке позволить использовать BioBricks в качестве стандарта сообщества с открытым исходным кодом, BioBricks Foundation создал Общественное соглашение BioBricks (BPA). BPA позволяет пользователям создавать изобретения использования частей, раскрывать патенты на комбинации частей и свободно использовать вклад других пользователей. [9] [10]

Стандарт сборки BioBrick [ править ]

Стандарт сборки BioBrick был введен для преодоления недостатка стандартизации, создаваемого традиционными методами молекулярного клонирования . Стандарт сборки BioBrick - это более надежный подход к объединению деталей в более крупные композиты. Стандарт сборки позволяет двум группам синтетических биологов в разных частях света повторно использовать деталь BioBrick, не проходя весь цикл проектирования и манипуляции. [2] Это означает, что новая разработанная часть может быть легко использована другими группами исследователей. Кроме того, по сравнению со старомодным методом специального клонирования стандартный процесс сборки выполняется быстрее и способствует автоматизации. [11]Стандарт сборки BioBrick 10 был первым введенным стандартом сборки. За прошедшие годы было разработано несколько других стандартов сборки, таких как стандарт Biofusion и стандарт Фрайбурга.

Стандарт сборки BioBrick 10 [ править ]

Стандартная сборка двух частей BioBrick (промотора и кодирующей последовательности) путем расщепления и лигирования, в результате чего образуется «рубцовый» сайт (M).

Стандарт сборки 10 был разработан Томом Найтом и является наиболее широко используемым стандартом сборки. Он предполагает использование рестрикционных ферментов . Каждая часть BioBrick представляет собой последовательность ДНК, переносимую кольцевой плазмидой , которая действует как вектор . [12] Вектор действует как транспортная система для транспортировки частей BioBrick. Первым подходом к стандарту BioBrick было введение стандартных последовательностей, префиксных и суффиксных последовательностей, которые фланкируют 5 'и 3' концы части ДНК соответственно. [13] Эти стандартные последовательности кодируют сайты специфических рестрикционных ферментов. Последовательность префикса кодирует сайты EcoRI (E) и Xbal (X), а последовательность суффикса кодируетСайты SpeI (S) и PstI (P). Префикс и суффикс не считаются частью BioBrick. [3] Чтобы облегчить процесс сборки, сама часть BioBrick не должна содержать какие-либо из этих сайтов ограничения. Во время сборки двух разных частей одна из плазмид переваривается EcoRI и SpeI . Плазмида, несущая другую часть BioBrick, расщепляется EcoRI и Xbal . Это оставляет обе плазмиды с выступами из 4 пар оснований (п.н.) на 5'- и 3'-концах. В EcoRI сайты будут перевязывать , так как они дополняют друг друга. Xbal и SpeIсайты также будут лигироваться, поскольку пищеварение дает совместимые концы. Теперь обе части ДНК находятся в одной плазмиде. В результате лигирования образуется «шрам» из 8 пар оснований между двумя частями BioBrick. Поскольку участок рубца представляет собой гибрид сайтов Xbal и SpeI , он не распознается ни одним из рестрикционных ферментов. [13] Последовательности префикса и суффикса остаются неизменными в процессе расщепления и лигирования, что позволяет выполнять последующие этапы сборки с большим количеством деталей BioBrick.

Эта сборка - идемпотентный процесс: несколько приложений не изменяют конечный продукт и сохраняют префикс и суффикс. Хотя стандартная сборка BioBrick допускает формирование функциональных модулей, этот стандартный подход имеет ограничение. Участок рубца длиной 8 п.н. не позволяет создавать слитый белок . [12] Участок рубца вызывает сдвиг рамки, который препятствует непрерывному считыванию кодонов, что необходимо для образования слитого белка.

Позже Том Найт разработал стандарт сборки BB-2 в 2008 году для решения проблем с соединением рубцов белковых доменов и того, что рубцы состоят из восьми оснований, что приведет к измененной рамке считывания при соединении белковых доменов. Ферменты, используемые для переваривания исходных частей, почти такие же, но с измененными приставками и суффиксами. [14]

Стандарт сборки BglBricks [ править ]

Стандарт сборки BglBrick был предложен Дж. Кристофером Андерсоном, Джоном Э. Дуэбером, Марианой Легия, Габриэлем К. Ву, Джонатаном С. Голером, Адамом П. Аркиным и Джеем Д. Кизлингом в сентябре 2009 года в качестве стандарта, очень похожего по концепции. в BioBrick, но позволяя генерировать гибридные белки без изменения рамки считывания или введения стоп-кодонов и при этом создавая относительно нейтральный рубец аминокислотного линкера (GlySer). Часть BglBrick представляет собой последовательность ДНК, фланкированную сайтами 5'-EcoRI и BglII (GAATTCaaaA GATCT ) и 3'-сайтами BamHI и XhoI ( GGATCCaaaCTCGAG) и внутренне лишены тех же сайтов рестрикции. Верхняя часть в попарной сборке очищается из гидролизата EcoRI / BamHI, а нижележащая часть + вектор очищается из гидролизата EcoRI / BglII. Лигирование этих двух фрагментов создает составную часть, реформирующую исходные фланкирующие сайты, требуемые в определении части, и оставляя рубцовую последовательность GGATCT на стыке частей, рубец, который кодирует аминокислоты глицин и серин при слиянии частей CDS вместе в рамке. , что удобно, поскольку дипептид GlySer является популярным линкером белковых доменов. [15]

Стандарт серебра (Biofusion) [ править ]

Сборка двух частей BioBrick для биослияния. На схематической диаграмме показан участок рубца из 6 пар оснований, образованный в результате делеции и вставки нуклеотида в сайты XbaI и SpeI .

Лаборатория Пэм Сильвер создала стандарт сборки Silver, чтобы решить проблему, связанную с образованием гибридного белка. Этот стандарт сборки также известен как стандарт Biofusion и является улучшением стандарта сборки BioBrick 10. Стандарт Silver включает делецию одного нуклеотида из сайтов Xbal и SpeI , что укорачивает участок рубца на 2 нуклеотида, который теперь образует 6 п.н. последовательность рубцов. Последовательность из 6 пар оснований позволяет сохранить рамку считывания. Рубцовая последовательность кодирует аминокислоту треонин (ACT) и аргинин (AGA). [16] Это незначительное улучшение позволяет формировать слитый белок в рамке считывания. Однако аргинин - большая заряженная аминокислота.является недостатком технологии сборки Biofusion: эти свойства аргинина приводят к дестабилизации белка по правилу N-конца .

Стандарт Фрайбурга [ править ]

В 2007 году команда Freiburg iGEM представила новый стандарт сборки, чтобы преодолеть недостатки существующей стандартной техники Biofusion. Команда Фрайбурга создала новый набор последовательностей префиксов и суффиксов, добавив дополнительные сайты рестрикционных ферментов, AgeI и NgoMIV, к существующим префиксу и суффиксу соответственно. Эти недавно представленные сайты рестрикционных ферментов совместимы со стандартом BioBrick. Стандарт Фрайбурга по-прежнему формирует участок рубца длиной 6 п.н., но последовательность рубца (ACCGGC) теперь кодирует треонин и глицин соответственно. Эта рубцовая последовательность приводит к гораздо более стабильному белку [17]поскольку глицин образует стабильный N-конец, в отличие от аргинина, который сигнализирует о деградации N-конца. Техника сборки, предложенная командой Фрайбурга, уменьшает ограничения стандарта Biofusion.

Метод сборки [ править ]

Когда дело доходит до сборки BioBricks, используются разные методы. Это связано с тем, что для некоторых стандартов требуются разные материалы и методы (использование разных рестрикционных ферментов), в то время как другие обусловлены предпочтениями в протоколе, поскольку некоторые методы сборки имеют более высокую эффективность и удобны для пользователя.

3 Сборка антибиотиков (3A) [ править ]

Метод сборки 3A является наиболее часто используемым, поскольку он совместим со стандартом сборки 10, стандартом Silver, а также стандартом Фрайбурга. Этот метод сборки включает две части BioBrick и целевую плазмиду. Плазмида-адресат содержит токсичный (летальный) ген, чтобы облегчить выбор правильно собранной плазмиды. Целевые плазмиды также имеют гены устойчивости к антибиотикам, отличные от плазмид, несущих части BioBrick. Все три плазмиды переваривают подходящим рестрикционным ферментом, а затем позволяют лигировать. Только правильно собранная часть будет производить жизнеспособную составную часть, содержащуюся в целевой плазмиде. Это обеспечивает хороший выбор, поскольку выживают только правильно собранные части BioBrick.

Усиленная сборка вставки [ править ]

Метод сборки амплифицированной вставки не зависит от последовательностей префиксов и суффиксов, что позволяет использовать его в сочетании с большинством стандартов сборки. Он также имеет более высокую скорость трансформации, чем сборка 3A, и не требует, чтобы участвующие плазмиды имели разные гены устойчивости к антибиотикам. Этот метод снижает шум от неразрезанных плазмид путем амплификации желаемой вставки с помощью ПЦР перед расщеплением и обработки смеси рестрикционным ферментом DpnI, который расщепляет метилированную ДНК, подобную плазмидам. Удаление матричных плазмид с DpnI оставляет только вставку для амплификации с помощью ПЦР. Чтобы уменьшить возможность создания плазмид с нежелательными комбинациями вставки и остова, остов можно обработать фосфатазой, чтобы предотвратить его повторное лигирование. [14]

Гибсон Scarless Assembly [ править ]

Метод сборки без зазоров Гибсона позволяет одновременно соединять несколько блоков BioBricks. Этот метод требует, чтобы желаемые последовательности имели перекрытие от 20 до 150 бит / с . Поскольку у BioBricks нет такого перекрытия, этот метод требует, чтобы праймеры ПЦР создавали выступы между соседними BioBricks. Экзонуклеаза Т5 атакует 5'-концы последовательностей, создавая одноцепочечную ДНК на концах всех последовательностей, где различные компоненты предназначены для отжига. Затем ДНК-полимераза добавляет части ДНК в промежутки в компонентах отжига, и лигаза Taq может запечатать конечные цепи. [14]

Сборка с помощью метилазы (4R / 2M) [ править ]

Метод сборки 4R / 2M был разработан для объединения частей (Стандарт сборки BioBrick 10 или Серебряный стандарт) в рамках существующих плазмид (то есть без ПЦР или субклонирования). Плазмиды реагируют in vivo с ДНК-метилтрансферазами, специфичными для последовательности, так что каждая из них модифицируется и защищается от одной из двух эндонуклеаз рестрикции, которые позже используются для линеаризации нежелательных продуктов кольцевого лигирования. [18]

Реестр запчастей [ править ]

Группа Массачусетского технологического института во главе с Томом Найтом, разработавшая конкурс BioBricks и International Genetically Engineered Machines (iGEM) , также является пионером Реестра стандартных биологических частей (Registry). [19] Реестр, являющийся одной из основ синтетической биологии, предоставляет в Интернете информацию и данные о более чем 20 000 частей BioBrick. Реестр содержит:

  • Информация и характеристики для всех частей, устройства и системы
  • Включает каталог, в котором описаны функции, характеристики и дизайн каждой детали.

Каждая деталь BioBrick имеет свой уникальный идентификационный код, который упрощает поиск нужной детали BioBrick (например, BBa_J23100, конститутивный промотор). [2] Доступ к реестру открыт, и каждый может отправить часть BioBrick. Большинство заявок на участие в программе BioBrick поступает от студентов, участвующих в ежегодном конкурсе iGEM, который проводится каждое лето. [20] Реестр позволяет обмениваться данными и материалами в режиме онлайн, что позволяет быстро повторно использовать и изменять части участвующим сообществом.

Также были разработаны профессиональные реестры запчастей. Поскольку большинство деталей BioBrick представлены студентами в рамках конкурса iGEM, в деталях могут отсутствовать важные характеристические данные и метаданные, которые были бы важны при проектировании и моделировании функциональных компонентов. [19] Одним из примеров реестра профессиональных запчастей является финансируемый государством объект в США, The International Open Facility Advancing Biotechnology (BIOFAB) , который содержит подробные описания каждой биологической части. Это также реестр с открытым исходным кодом, доступный на коммерческой основе. BIOFAB стремится каталогизировать высококачественные детали BioBrick, чтобы удовлетворить потребности профессионального сообщества синтетических биологов.

BioBrick Foundation (BBF) является общественно-полезной организацией , созданной для содействия использованию стандартизированных частей BioBrick по шкале вне конкурса ИГЕМ. BBF в настоящее время работает над созданием стандартной структуры для продвижения производства высококачественных деталей из BioBrick, которые будут доступны каждому бесплатно. [21]

См. Также [ править ]

  • Синтетическая биология
  • Влажная посуда
  • iGEM ​​Competition

Ссылки [ править ]

  1. ^ Рыцарь, Томас (2003). «Том Найт (2003). Дизайн идемпотентных векторов для стандартной сборки биокирпичей». ЛВП : 1721,1 / 21168 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  2. ^ a b c d Рыцарь, Томас Ф; Решма П. Шетти; Дрю Энди (14 апреля 2008 г.). «Разработка векторов BioBrick из частей BioBrick» . Журнал биологической инженерии . 2 (5): 5. DOI : 10,1186 / 1754-1611-2-5 . PMC 2373286 . PMID 18410688 .  
  3. ^ a b «Стандарты SynBio -BioBrick» (PDF) . Архивировано из оригинального (PDF) 27 марта 2014 года . Проверено 27 марта 2014 года .
  4. ^ Шетти, Решма П .; Энди, Дрю; Найт, Томас Ф. (14 апреля 2008 г.). «Разработка векторов BioBrick из частей BioBrick» . Журнал биологической инженерии . 2 (1): 5. DOI : 10,1186 / 1754-1611-2-5 . ISSN 1754-1611 . PMC 2373286 . PMID 18410688 .   
  5. ^ Rebatchouk Дмитрий; Daraselia, N .; Нарита, JO (1 октября 1996 г.). «NOMAD: универсальная стратегия манипуляции с ДНК in vitro, применяемая для анализа промоторов и дизайна векторов» . Труды Национальной академии наук . 93 (20): 10891–10896. Bibcode : 1996PNAS ... 9310891R . DOI : 10.1073 / pnas.93.20.10891 . PMC 38253 . PMID 8855278 .  
  6. ^ Аркин, Адам. «Стандартный список деталей для биологической схемы» (PDF) . Проверено 27 марта 2014 года .
  7. ^ «О - Фонд BioBricks» . Фонд BioBricks . Архивировано из оригинала на 2015-11-13 . Проверено 4 ноября 2015 .
  8. ^ "Программы - Фонд BioBricks" . Фонд BioBricks . Архивировано из оригинала на 2015-09-17 . Проверено 4 ноября 2015 .
  9. ^ Марк, Фишер; Ли, экипажи; Дженнифер, Линч; Джейсон, Шульц; Дэвид, Гревал; Дрю, Энди (2009-10-18). «Общественное соглашение BioBrick v1 (черновик)». hdl : 1721,1 / 49434 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  10. ^ Smolke, Кристина D (2009). «Нестандартное строительство: iGEM и BioBricks Foundation». Природа Биотехнологии . 27 (12): 1099–1102. DOI : 10.1038 / nbt1209-1099 . PMID 20010584 . 
  11. ^ "J5 автоматизированная сборка ДНК - подход BioBrick" .
  12. ^ a b Sleight, SC; Бартли, BA; Lieviant, JA; Сауро, HM (12 апреля 2010 г.). «Сборка и модернизация In-Fusion BioBrick» . Исследования нуклеиновых кислот . 38 (8): 2624–2636. DOI : 10.1093 / NAR / gkq179 . PMC 2860134 . PMID 20385581 .  
  13. ^ a b Шетти, Р .; Lizarazo, M .; Rettberg, R .; Рыцарь, TF (2011). Сборка стандартных биологических частей BioBrick с использованием сборки из трех антибиотиков . Методы в энзимологии . 498 . С. 311–26. DOI : 10.1016 / B978-0-12-385120-8.00013-9 . ЛВП : 1721,1 / 65066 . ISBN 9780123851208. PMID  21601683 .
  14. ^ a b c Røkke, G .; Корвальд, Э .; Pahr, J .; Oyås, O .; Лале, Р. (01.01.2014). Валла, Свейн; Лале, Рахми (ред.). Стандарты и методы сборки BioBrick и связанные с ними программные инструменты . Методы молекулярной биологии. 1116 . Humana Press. С. 1–24. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-764-8_1 . ISBN 978-1-62703-763-1. PMID  24395353 .
  15. ^ Шетти, Решма П; Энди, Дрю; Рыцарь, Томас Ф (2008). «Разработка векторов BioBrick из частей BioBrick» . Журнал биологической инженерии . 2 (1): 5. DOI : 10,1186 / 1754-1611-2-5 . ISSN 1754-1611 . PMC 2373286 . PMID 18410688 .   
  16. ^ Сильвер, Памела А .; Ира Э. Филлипс (18 апреля 2006 г.). «Новая стратегия сборки биокирпича, разработанная для легкой инженерии белков» (PDF) . Гарвардская медицинская школа : 1–6.
  17. ^ Мюллер, Кристиан М. "dspace.mit.edu/bitstream/handle/1721.1/45140/BBF_RFC%2025.pdf?sequence=1" (PDF) . Массачусетский технологический институт . Проверено 27 марта 2014 года .
  18. ^ Мацумура I. 2020. Субклонирование с помощью метилазы для высокопроизводительной сборки BioBrick. PeerJ 8: e9841 https://doi.org/10.7717/peerj.9841
  19. ^ a b Болдуин, Джефф (2012). Синтетическая биология A Primer . Лондон: Имперский колледж пр. ISBN 978-1848168633.
  20. ^ "Главная страница - ung.igem.org" . igem.org . Проверено 10 ноября 2015 .
  21. ^ «О Фонде BioBricks» . Архивировано из оригинального 13 ноября 2015 года . Проверено 27 марта 2014 года .