Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Лабораторный разрушитель клеток

Разрушение клетки - это метод или процесс высвобождения биологических молекул изнутри клетки .

Методы [ править ]

Производство биологически интересных молекул с использованием методов клонирования и культивирования позволяет изучать и производить соответствующие молекулы. За исключением выделяемых молекул, клетки, производящие интересующие молекулы, должны быть разрушены. На этой странице обсуждаются различные методы. Другой метод разрушения называется снятие кровли с клетки .

Метод бисера [ править ]

Обычный лабораторный механический метод разрушения клеток использует стеклянные, керамические или стальные шарики диаметром от 0,1 до 2 мм, смешанные с образцом, суспендированным в водной среде. Впервые разработанная Тимом Хопкинсом в конце 1970-х годов смесь образца и гранул подвергается сильному перемешиванию путем перемешивания или встряхивания. Гранулы сталкиваются с клеточным образцом, открывая клетку и высвобождая межклеточные компоненты. В отличие от некоторых других методов, механический сдвиг умеренный во время гомогенизации, что приводит к превосходным мембранным или субклеточным препаратам. Метод, часто называемый «взбиванием», хорошо работает со всеми типами клеточного материала - от спор до тканей животных и растений. Это наиболее широко используемый метод лизиса дрожжей, который может давать ломкость более 50% (до 95%). [1] Он имеет преимущество перед другими методами механического разрушения клеток, так как он может разрушать образцы очень небольшого размера, обрабатывать множество образцов за один раз, не опасаясь перекрестного загрязнения, и не выделяет потенциально вредные аэрозоли в процессе.

В простейшем примере метода равный объем шариков добавляется к суспензии клеток или тканей в пробирке, и образец интенсивно перемешивается на обычном лабораторном вихревом смесителе. Хотя время обработки невелико и занимает в 3-10 раз больше, чем в специальных встряхивающих машинах, он хорошо работает с легко разрушаемыми ячейками и стоит недорого.

Успешное взбивание шариков зависит не только от конструктивных особенностей машины для встряхивания (которые учитывают колебания при встряхивании в минуту, выброс или расстояние при встряхивании, ориентацию встряхивания и ориентацию флакона), но и от выбора правильного размера шариков (диаметр 0,1–6 мм) состав шариков (стекло, керамика, сталь) и загрузка шариков во флаконе.

В большинстве лабораторий взбивание гранул производится партиями от одного до двадцати четырех запечатанных пластиковых флаконов или центрифужных пробирок. Образец и крошечные шарики перемешиваются со скоростью около 2000 колебаний в минуту в специально разработанных возвратно-поступательных шейкерах, приводимых в движение электродвигателями большой мощности. Разрушение клеток завершается через 1–3 минуты встряхивания. Значительно более высокие темпы разрушения клеток достигаются с помощью разновидности Beadbeater под названием SoniBeast. В отличие от обычных машин, он перемешивает шарики с помощью вихревого движения со скоростью 20000 об / мин. Более крупные микропланшеты с микротитровальными пластинами с глубокими лунками также сокращают время процесса, как и дозаторы гранул, предназначенные для быстрой загрузки гранул в несколько флаконов или микропланшетов. [2] [3] Также доступны предварительно загруженные флаконы и микропланшеты.

Все машины для взбивания шариков с высокой энергией нагревают образец примерно на 10 градусов в минуту. Это происходит из-за фрикционных столкновений шариков во время гомогенизации. Охлаждение образца во время или после взбивания гранул может быть необходимо для предотвращения повреждения термочувствительных белков, таких как ферменты. Нагревание образца можно контролировать путем взбивания шариков в течение коротких интервалов времени с охлаждением на льду между каждым интервалом, путем обработки пробирок в предварительно охлажденных алюминиевых держателях для пробирок или путем циркуляции газообразного хладагента через устройство во время взбивания шариков.

Другая конфигурация взбивания шариков, подходящая для больших объемов образцов, использует вращающийся фторуглеродный ротор внутри камеры объемом 15, 50 или 200 мл для перемешивания шариков. В этой конфигурации камера может быть окружена статической охлаждающей рубашкой. Используя ту же конфигурацию ротора / камеры, доступны большие коммерческие машины для обработки многих литров клеточной суспензии . В настоящее время эти машины ограничены обработкой одноклеточных организмов, таких как дрожжи, водоросли и бактерии.

Криопульверизация [ править ]

Образцы с твердым внеклеточным матриксом, такие как соединительная ткань животных, некоторые образцы биопсии опухоли, венозная ткань, хрящ, семена и т. Д., Измельчаются до тонкого порошка путем ударного измельчения при температурах жидкого азота. Этот метод, известный как криопульверизация, основан на том факте, что биологические образцы, содержащие значительную долю воды, становятся хрупкими при очень низких температурах. Этот метод был впервые описан Смакером и Пфистером в 1975 году, которые назвали его криоударом. Авторы продемонстрировали, что клетки эффективно разрушаются этим методом, подтверждая с помощью фазовой и электронной микроскопии, что плоскости разрушения пересекают клеточные стенки и цитоплазматические мембраны. [4]

Эту технику можно осуществить, используя ступку и пестик, охлажденные до температуры жидкого азота, но использование этого классического прибора трудоемко, и потеря образца часто вызывает беспокойство. Для этой цели также доступны специализированные измельчители из нержавеющей стали, известные как измельчители тканей. Они требуют меньше ручных усилий, обеспечивают хорошее извлечение пробы и их легко чистить между пробами. Преимущества этого метода - более высокие выходы белков и нуклеиновых кислот из небольших образцов твердых тканей - особенно при использовании в качестве предварительного этапа к упомянутым выше методам механического или химического / химического разрушения клеток.

Разрушение ячейки высокого давления [ править ]

С 1940-х годов высокое давление использовалось как метод разрушения клеток, в первую очередь французским прессом для ячеек под давлением или сокращенно French Press. Этот метод был разработан Чарльзом Стейси Френчем и использует высокое давление для проталкивания клеток через узкое отверстие, заставляя клетки лизироваться из-за сил сдвига, возникающих при перепаде давления. [5] [6] Хотя французские прессы стали основным продуктом во многих микробиологических лабораториях, их производство было в значительной степени прекращено, что привело к возрождению альтернативных применений аналогичной технологии.

Современные физические разрушители клеток обычно работают за счет пневматического или гидравлического давления. Хотя пневматические машины обычно имеют более низкую стоимость, их работа может быть ненадежной из-за колебаний рабочего давления на протяжении всего хода воздушного насоса. Обычно считается, что гидравлические машины обладают превосходной лизирующей способностью, особенно при обработке более трудно разрушаемых образцов, таких как дрожжевые или грамположительные бактерии.благодаря их способности поддерживать постоянное давление на протяжении всего хода поршня. Поскольку French Press, который управляется гидравлическим давлением, способен к лизису более 90% наиболее часто используемых типов клеток, он часто считается золотым стандартом в производительности лизиса, и современные машины часто сравнивают с ним не только с точки зрения лизиса. эффективность, но также с точки зрения безопасности и простоты использования. Некоторые производители также пытаются улучшить традиционную конструкцию, изменяя в этих машинах свойства, отличные от давления, при котором образец проходит через отверстие. Одним из таких примеров является компания Constant Systems, которая недавно продемонстрировала, что их разрушители клеток не только соответствуют характеристикам традиционной французской прессы, но также стремятся достичь тех же результатов при гораздо меньшей мощности. [7]

Технология цикла давления («PCT»). PCT - это запатентованная технологическая платформа, которая использует чередующиеся циклы гидростатического давления между окружающим и сверхвысоким уровнями (до 90 000 фунтов на квадратный дюйм) для безопасного, удобного и воспроизводимого контроля действий молекул в биологических образцах, например, разрыва (лизиса) клеток и тканей человека, животных, растений и микробов, а также инактивация патогенов. Системы с повышенным содержанием PCT (инструменты и расходные материалы) решают некоторые сложные проблемы, присущие подготовке биологических проб. Преимущества ПКТ включают: (а) экстракцию и восстановление большего количества мембранных белков, (б) улучшенное переваривание белков, (в) дифференциальный лизис в смешанной основе образца, (г) инактивацию патогенов, (д) ​​повышенное обнаружение ДНК и (е) изысканный контроль процесса пробоподготовки. [8]


Метод микрофлюидизатора, используемый для разрушения клеток, сильно влияет на физико-химические свойства суспензии лизированных клеток, такие как размер частиц, вязкость, выход белка и активность ферментов. В последние годы метод микрофлюидизатора приобрел популярность при разрушении клеток благодаря простоте использования и эффективности при разрушении множества различных типов клеток. Технология Microfluidizer была лицензирована компанией Arthur D. Little и впервые была разработана и использована в 1980-х годах, первоначально как инструмент для создания липосом . С тех пор он использовался в других приложениях, таких как наноэмульсии для разрушения клеток и уменьшение размера твердых частиц, среди прочего.

Используя микроканалы с фиксированной геометрией и усилительный насос, создаются высокие скорости сдвига , которые разрушают клетки. Этот метод лизиса клеток может привести к разрушению более 90% клеток E. coli. [9]

Многие белки чрезвычайно чувствительны к температуре и во многих случаях могут начать денатурировать при температуре всего 4 градуса Цельсия. Внутри микроканалов температура превышает 4 градуса по Цельсию, но устройство спроектировано так, чтобы быстро охлаждаться, поэтому время воздействия на клетки повышенных температур чрезвычайно короткое ( время пребывания 25-40 мс). Благодаря такому эффективному контролю температуры микрофлюидизатор обеспечивает более высокие уровни активных белков и ферментов, чем другие механические методы, когда белки чувствительны к температуре. [10]

Изменения вязкости также часто наблюдаются при разрушении клеток. Если вязкость клеточной суспензии высока, это может затруднить последующую обработку, такую ​​как фильтрация и точное дозирование. Изменения вязкости, наблюдаемые при использовании микрофлюидизатора, относительно невелики и уменьшаются при дополнительных проходах через устройство. [11]

В отличие от других методов механического разрушения, микрофлюидизатор разрушает клеточные мембраны эффективно, но мягко, в результате чего образуются относительно большие фрагменты клеточной стенки (450 нм), что облегчает разделение содержимого клетки. Это может привести к сокращению времени фильтрации и лучшему разделению при центрифугировании. [12]

Технология микрофлюидизатора масштабируется от одного миллилитра до тысяч литров.

Декомпрессия азотом [ править ]

Для декомпрессии азота большие количества азота сначала растворяются в ячейке под высоким давлением в подходящем сосуде высокого давления . Затем, когда давление газа внезапно сбрасывается, азот выходит из раствора в виде расширяющихся пузырьков, которые растягивают мембраны каждой клетки до тех пор, пока они не разорвутся и не выпустят содержимое клетки.

Азотная декомпрессия лучше защищает ферменты и органеллы, чем ультразвуковые и механические методы гомогенизации, и выгодно отличается от контролируемого разрушающего воздействия, достигаемого в гомогенизаторе с пестиком и ПТФЭ и стеклянной ступке. [13] В то время как другие методы разрушения зависят от трения или механического сдвигающего действия, которое генерирует тепло, процедура декомпрессии азота сопровождается адиабатическим расширением, которое охлаждает образец, а не нагревает его.

Покрытие из инертного газообразного азота, которое насыщает суспензию клеток и гомогенат, обеспечивает защиту от окисления компонентов клеток. Хотя в этом методе использовались другие газы: диоксид углерода , закись азота , монооксид углерода и сжатый воздух, предпочтение отдается азоту из-за его нереактивной природы и потому, что он не изменяет pH суспендирующей среды. Кроме того, предпочтителен азот, поскольку он обычно доступен по низкой цене и при давлении, подходящем для этой процедуры.

После высвобождения субклеточные вещества не подвергаются продолжительному истиранию, которое могло бы денатурировать образец или вызвать нежелательное повреждение. Нет необходимости следить за пиком между активностью фермента и процентом нарушения. Поскольку в каждой ячейке образуются пузырьки азота, одинаковая разрушающая сила применяется равномерно по всему образцу, обеспечивая таким образом необычную однородность продукта. Могут быть получены бесклеточные гомогенаты.

Этот метод используется для гомогенизации клеток и тканей, высвобождения интактных органелл , подготовки клеточных мембран , высвобождения лабильных биохимических веществ и получения однородных и повторяемых гомогенатов, не подвергая образец экстремальным химическим или физическим нагрузкам.

Этот метод особенно хорошо подходит для лечения клеток млекопитающих и других мембраносвязанных клеток. [14] Он также успешно использовался для лечения клеток растений , для высвобождения вируса из оплодотворенных яиц и для лечения хрупких бактерий . Не рекомендуется для необработанных бактериальных клеток. Дрожжи , грибки , споры и другие материалы с прочными клеточными стенками плохо поддаются этому методу.

См. Также [ править ]

  • Ультразвуковой гомогенизатор
  • Обработка ультразвуком
  • Гомогенизация (химия)
  • Гомогенизатор

Ссылки [ править ]

  1. ^ EMBL - Управление информации и связей с общественностью. «Очистка белков» . embl.de . Дата обращения 19 мая 2015 .
  2. ^ "Архивная копия" . Архивировано из оригинала на 2017-04-25 . Проверено 24 апреля 2017 .CS1 maint: archived copy as title (link)
  3. ^ https://www.biospec.com/category/bead-loaders
  4. ^ Крио-воздействие жидким азотом: новая концепция разрушения клеток. Ричард А. Смакер, Роберт М. Пфистер. Appl Microbiol. 1975 сентябрь; 30 (3): 445–449.
  5. ^ Фотохимическая активность изолированных хлоропластов. CS French, HW Milner, ML Koenig и FDH Macdowall. Карн. Inst. Мыть. Годb. 1948; 47: 91-93
  6. ^ Процесс фотохимического восстановления в фотосинтезе. В симпозиумах Общества экспериментальной биологии. К.С. Французский, Х.В. Мильнер. V. Фиксация углекислого газа и фотосинтез. 232-250. Издательство Кембриджского университета, Нью-Йорк.
  7. ^ Под давлением, М. Лоугер, Европейский биофармацевтический обзор, июль 2016 г .; 12–16
  8. ^ http://www.pressurebiosciences.com/documents?task=document.viewdoc&id=64
  9. ^ Оценка микрофлюидизатора для разрушения клеток дрожжей и хлореллы Э. Уэра-Сантос, CD Copple, EA Davis и WG. Агарь.
  10. ^ agerkvist, Irene, и Sven-Olof Enfors. «Характеристика распада клеток E. Coli из бисера и гомогенизатора высокого давления». Биотехнология и биоинженерия Biotechnol.Bioeng.36.11 (1990): 1083-089.Web.
  11. ^ agerkvist, Irene, и Sven-Olof Enfors. «Характеристика распада клеток E. Coli из бисера и гомогенизатора высокого давления». Биотехнология и биоинженерия Biotechnol.Bioeng.36.11 (1990): 1083-089.Web.
  12. ^ Оценка микрофлюидизатора для разрушения клеток дрожжей и хлореллы Э. Уэра-Сантос, CD Copple, EA Davis и WG. Агарь.
  13. ^ "Инструменты Парра - Сосуд для разрушения клеток, внутренний объем 1 галлон - Джон Моррис" . www.johnmorrisgroup.com . Проверено 13 декабря 2019 .
  14. ^ «Приложения» . Компания Parr Instrument . Проверено 13 декабря 2019 .