Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Хемостат
Схема хемостата
Схема хемостата, показывающая приток (питание) и отток (стоки).
ПромышленностьБиологическая инженерия
ЗаявлениеИсследования и промышленность
Закрытый сосуд для хемостата с непрерывным и регулируемым притоком среды и оттоком стоков, используемый для контролируемого роста микроорганизмов. Система поддерживает постоянный объем и уровень аэрации. Скорость роста микроорганизмов регулируется путем изменения притока свежей среды, в то время как плотность популяции регулируется путем изменения концентрации ограничивающего питательного вещества. Эта открытая система позволяет исследователям поддерживать экспоненциальную фазу роста клеток для использования в физиологических экспериментах. [1]

Хемостатическое (от CHEM ческой среды является стат IC) представляет собой биореактор , к которому непрерывно добавляют свежая среда, в то время как культуральная жидкость , содержащие питательные вещества , оставшийся, метаболические конечные продукты и микроорганизмы непрерывно удаляют с той же скоростью , чтобы поддерживать постоянный объем культуры. [2] [3] путь изменения скорости , с которой среда добавляются в биореактор удельная скорость роста из микроорганизма может быть легко контролируемыми пределами.

Операция [ править ]

Устойчивое состояние [ править ]

Одна из наиболее важных особенностей хемостатов заключается в том, что микроорганизмы можно выращивать в физиологически устойчивом состоянии при постоянных условиях окружающей среды. В этом устойчивом состоянии рост происходит с постоянной удельной скоростью роста, и все параметры культуры остаются постоянными (объем культуры, концентрация растворенного кислорода, концентрации питательных веществ и продуктов, pH, плотность клеток и т. Д.). Кроме того, экспериментатор может контролировать условия окружающей среды. [4]Микроорганизмы, растущие в хемостатах, обычно достигают устойчивого состояния из-за отрицательной обратной связи между скоростью роста и потреблением питательных веществ: если в биореакторе присутствует небольшое количество клеток, клетки могут расти со скоростью выше, чем скорость разведения, поскольку они потребляют мало питательных веществ. поэтому рост меньше ограничивается добавлением ограничивающих питательных веществс втекающей свежей средой. Ограничивающее питательное вещество - это питательное вещество, необходимое для роста, присутствующее в среде в предельной концентрации (все другие питательные вещества обычно поставляются в избытке). Однако чем больше становится количество клеток, тем больше питательного вещества потребляется, что снижает концентрацию ограничивающего питательного вещества. В свою очередь, это снизит удельную скорость роста клеток, что приведет к уменьшению количества клеток, поскольку они продолжают удаляться из системы с оттоком. Это приводит к устойчивому состоянию. Благодаря саморегулированию устойчивое состояние является стабильным. Это позволяет экспериментатору контролировать конкретную скорость роста микроорганизмов, изменяя скорость насоса, подающего свежую среду в сосуд.

Хорошо перемешанный [ править ]

Другой важной особенностью хемостатов и других систем непрерывного культивирования является то, что они хорошо перемешаны, так что условия окружающей среды являются однородными или однородными, а микроорганизмы случайным образом рассредоточены и случайно встречаются друг с другом. Следовательно, конкуренция и другие взаимодействия в хемостате глобальны, в отличие от биопленок .

Скорость разбавления [ править ]

Скорость обмена питательных веществ выражается в виде степени разбавления  D . В устойчивом состоянии, удельная скорость роста  μ из микроорганизма равна скорости разбавления  D . Скорость разбавления определяется как расход среды в единицу времени, F , в объеме  V культуры в биореакторе.

Максимальная скорость роста и критическая скорость разбавления [ править ]

Удельная скорость роста  μ обратно пропорциональна времени, необходимому для удвоения биомассы, называемому временем удвоения  t d , следующим образом:

Следовательно, время удвоения t d становится функцией степени разбавления  D в установившемся режиме:

Каждый микроорганизм, растущий на определенном субстрате, имеет максимальную удельную скорость роста μ max (скорость роста, наблюдаемая, если рост ограничивается внутренними ограничениями, а не внешними питательными веществами). Если выбран уровень разбавления выше, чем μ max , клетки не могут расти со скоростью, с которой они удаляются, поэтому культура не сможет поддерживать себя в биореакторе и вымывается.

Однако, поскольку концентрация ограничивающего питательного вещества в хемостате не может превышать концентрацию в корме, удельная скорость роста, которой могут достичь клетки в хемостате, обычно немного ниже максимальной удельной скорости роста, поскольку удельная скорость роста обычно увеличивается с питательным веществом. концентрации, как описано кинетикой уравнения Моно . [ необходима цитата ] Наивысшая удельная скорость роста ( μ max ) клеток равна критической скорости разведения ( D ' c ):

где S - концентрация субстрата или питательного вещества в хемостате, а K S - константа полунасыщения (это уравнение предполагает кинетику Моно).

Приложения [ править ]

Исследование [ править ]

Хемостаты в исследованиях используются для исследований в области клеточной биологии как источник больших объемов однородных клеток или белка. Хемостат часто используется для сбора устойчивых данных об организме с целью создания математической модели, относящейся к его метаболическим процессам. Хемостаты также используются как микрокосмы в экологии [5] [6] и эволюционной биологии. [7] [8] [9] [10] В одном случае мутация / отбор является помехой, в другом - это исследуемый желаемый процесс. Хемостаты также могут использоваться для обогащения определенных типов бактериальных мутантов в культуре, таких как ауксотрофы или те, которые устойчивы к антибиотикам.или бактериофаги для дальнейшего научного изучения. [11] Вариации скорости разведения позволяют изучать метаболические стратегии, проводимые организмами при разной скорости роста. [12] [13]

Конкуренция за один или несколько ресурсов, эволюция путей получения и использования ресурсов, перекрестное кормление / симбиоз, [14] [15] антагонизм, хищничество и конкуренция между хищниками - все это изучается в экологии и эволюционной биологии с использованием хемостатов. [16] [17] [18]

Промышленность [ править ]

Хемостаты часто используются в промышленном производстве этанола . В этом случае последовательно используют несколько хемостатов, каждый из которых поддерживает пониженную концентрацию сахара. [ необходима цитата ] Хемостат также служит экспериментальной моделью непрерывных культур клеток в биотехнологической промышленности. [13]

Технические проблемы [ править ]

  • Вспенивание приводит к переполнению, при этом объем жидкости не совсем постоянный.
  • Некоторые очень хрупкие клетки разрываются при перемешивании и аэрации .
  • Клетки могут расти на стенках или прилипать к другим поверхностям [19], что можно преодолеть, обработав стеклянные стенки сосуда силаном, чтобы сделать их гидрофобными. Однако ячейки будут выбраны для прикрепления к стенам, поскольку те, которые есть, не будут удалены из системы. Те бактерии, которые прочно прилипают к стенкам, образуя биопленку , трудно изучать в условиях хемостата.
  • Смешивание может быть неоднородным, что нарушает «статичность» хемостата.
  • Капание среды в камеру на самом деле приводит к небольшим импульсам питательных веществ и, следовательно, к колебаниям концентраций, снова нарушая «статические» свойства хемостата.
  • Бактерии довольно легко перемещаются вверх по течению. Они быстро достигнут резервуара со стерильной средой, если путь жидкости не прерван воздушным разрывом, в котором среда каплями падает через воздух.

Постоянные усилия по исправлению каждого дефекта довольно часто приводят к изменению базового хемостата. Примеры в литературе многочисленны.

  • Пеногасители используются для подавления пенообразования.
  • Перемешивание и аэрация можно проводить осторожно.
  • Было принято много подходов к уменьшению роста стенок [20] [21]
  • В различных приложениях для перемешивания используются лопасти, барботаж или другие механизмы [22]
  • Капание можно сделать менее сильным с помощью более мелких капель и большего объема емкости
  • Многие улучшения нацелены на угрозу заражения

Соображения по экспериментальному дизайну [ править ]

Выбор и настройка параметров [ править ]

[23]

  • Установившаяся концентрация ограничивающего субстрата в хемостате не зависит от концентрации притока. Концентрация притока будет влиять на концентрацию клеток и, следовательно, на ОП в установившемся состоянии.
  • Несмотря на то, что предельная концентрация субстрата в хемостате обычно очень низкая и поддерживается дискретными высококонцентрированными импульсами притока, на практике временное изменение концентрации внутри хемостата невелико (несколько процентов или меньше) и, таким образом, может рассматриваться как квазистационарное состояние.
  • Время, необходимое для того, чтобы плотность клеток (OD) приблизилась к установившемуся значению (превышение / недостижение), часто будет долгим (многократные обороты хемостата), особенно, когда начальный посевной материал большой. Но время можно минимизировать при правильном выборе параметров.

Устойчивый рост состояния [ править ]

[23]

  • Может показаться, что хемостат находится в устойчивом состоянии, но поглощения мутантных штаммов могут происходить непрерывно, даже если они не обнаруживаются путем мониторинга параметров макроуровня, таких как OD или концентрации продукта.
  • Лимитирующий субстрат обычно находится в таких низких концентрациях, что его невозможно обнаружить. В результате концентрация ограничивающего субстрата может сильно изменяться во времени (в процентном отношении), поскольку разные штаммы захватывают популяцию, даже если результирующие изменения OD слишком малы для обнаружения.
  • «Импульсный» хемостат (с очень большими импульсами притока) имеет существенно более низкую селективную способность, чем стандартный квазинепрерывный хемостат, для мутантного штамма с повышенной приспособленностью к ограничивающим условиям.
  • Путем резкого снижения концентрации субстрата, ограничивающего приток, можно временно подвергнуть клетки относительно более жестким условиям, пока хемостат не стабилизируется обратно в устойчивое состояние (во временном порядке степени разбавления D).

Мутация [ править ]

[23]

  • Некоторые типы мутантных штаммов появятся быстро:
    • Если есть SNP, который может повысить приспособленность, он должен появиться в популяции только после нескольких удвоений хемостата, для характерно больших хемостатов (например, 10 ^ 11 клеток E. coli ).
    • Штамм, для которого требуются два конкретных SNP, где только их комбинация дает преимущество пригодности (тогда как каждый из них по отдельности является нейтральным), вероятно, появится только в том случае, если целевой размер (количество различных местоположений SNP, вызывающих полезную мутацию) для каждого SNP очень большой.
  • Маловероятно появление других типов мутантных штаммов (например, двух SNP с малым размером мишени, большего количества SNP или хемостатов меньшего размера).
    • Эти другие мутации ожидаются только в результате последовательного охвата мутантов с преимуществом приспособленности. Можно ожидать появления нескольких мутантов только в том случае, если каждая мутация является независимой, а не в тех случаях, когда мутации индивидуально нейтральны, но вместе полезны. Последовательные поглощения - единственный надежный способ эволюции в хемостате.
  • Казалось бы, крайний сценарий, когда мы требуем, чтобы каждый возможный SNP хотя бы один раз сосуществовал в хемостате, на самом деле весьма вероятен. Большой хемостат, скорее всего, достигнет этого состояния.
  • Для большого хемостата ожидаемое время до появления полезной мутации порядка времени оборота хемостата. Обратите внимание, что это обычно значительно меньше времени, в течение которого полезный штамм захватывает популяцию хемостата. Это не обязательно так в маленьком хемостате.
  • Ожидается, что указанные выше точки будут одинаковыми для разных бесполых репродуктивных видов ( E. coli , S. cerevisiae и т. Д.).
  • Более того, время до появления мутации не зависит от размера генома, но зависит от скорости мутации на BP.
  • Для характерно больших хемостатов гипермутантный штамм не дает достаточно преимуществ, чтобы их можно было использовать. Кроме того, у него недостаточно избирательного преимущества, чтобы можно было ожидать, что он всегда будет проявляться в результате случайной мутации и захватить хемостат.

Единое поглощение [ править ]

[23]

  • Время перехода предсказуемо с учетом соответствующих параметров деформации.
  • Разные степени разбавления выборочно способствуют тому, что разные мутантные штаммы захватывают популяцию хемостата, если такой штамм существует. Например:
    • Высокая скорость разведения создает давление отбора для мутантного штамма с повышенной максимальной скоростью роста;
    • Средняя степень разбавления создает давление отбора для мутантного штамма с более высоким сродством к ограничивающему субстрату;
    • Низкая скорость разведения создает давление отбора для мутантного штамма, который может расти в среде без ограничивающего субстрата (предположительно, за счет потребления другого субстрата, присутствующего в среде);
  • Время захвата превосходящего мутанта будет довольно постоянным во всем диапазоне рабочих параметров. Для характерных рабочих значений время принятия составляет от дней до недель.

Последовательные поглощения [ править ]

[23]

  • При подходящих условиях (достаточно большая популяция и несколько мишеней в геноме для простых полезных мутаций) ожидается, что несколько штаммов будут последовательно захватывать популяцию, и делать это будет относительно синхронизировано и темпами. Время зависит от типа мутации.
  • При последовательном заимствовании, даже если избирательное улучшение каждого из штаммов остается постоянным (например, каждый новый штамм лучше предыдущего штамма на постоянный коэффициент) - скорость заимствования не остается постоянной, а скорее уменьшается от штамма к штамму.
  • Бывают случаи, когда последовательные поглощения происходят так быстро, что очень трудно различать штаммы, даже при изучении частоты аллелей. Таким образом, линия множественного поглощения последовательных штаммов может проявиться как поглощение одного штамма с когортой мутаций.

Варианты [ править ]

Установки ферментации, тесно связанные с хемостатами, - это турбидостат , ауксостат и ретентостат . В ретентостатах культуральная жидкость также удаляется из биореактора, но фильтр задерживает биомассу. В этом случае концентрация биомассы увеличивается до тех пор, пока потребность в питательных веществах для поддержания биомассы не сравняется с количеством ограничивающего питательного вещества, которое может быть потреблено.

См. Также [ править ]

  • Бактериальный рост
  • Биохимическая инженерия
  • Реактор непрерывного действия с мешалкой (CSTR)
  • E. coli эксперимент долгосрочной эволюции
  • Fed-партия

Ссылки [ править ]

  1. ^ Мэдиган, Майкл (2015). Брок Биология микроорганизмов . Пирсон. С. 152–153. ISBN 978-0-321-89739-8.
  2. ^ Новик А, Сциллард L (1950). «Описание хемостата». Наука . 112 (2920): 715–6. Bibcode : 1950Sci ... 112..715N . DOI : 10.1126 / science.112.2920.715 . PMID 14787503 . 
  3. ^ Джеймс TW (1961). «Непрерывное культивирование микроорганизмов». Ежегодный обзор микробиологии . 15 : 27–46. DOI : 10.1146 / annurev.mi.15.100161.000331 .
  4. ^ D Герберт; Р. Элсворт; RC Telling (1956). «Непрерывная культура бактерий; теоретическое и экспериментальное исследование» . J. Gen. Microbiol . 14 (3): 601–622. DOI : 10.1099 / 00221287-14-3-601 . PMID 13346021 . 
  5. ^ Бекс л, Хилькер FM - , Мальхи Н, Юргенс К, Арндт Н (2005). «Экспериментальная демонстрация хаоса в микробной пищевой сети». Природа . 435 (7046): 1226–9. Bibcode : 2005Natur.435.1226B . DOI : 10,1038 / природа03627 . PMID 15988524 . 
  6. ^ Pavlou S, Kevrekidis IG (1992). «Микробное хищничество в периодически работающем хемостате: глобальное исследование взаимодействия между естественными и внешними частотами». Math Biosci . 108 (1): 1–55. DOI : 10.1016 / 0025-5564 (92) 90002-E . PMID 1550993 . 
  7. ^ Wichman HA, Миллстейн J, Bull JJ (2005). «Адаптивная молекулярная эволюция для 13 000 поколений фагов: возможная гонка вооружений» . Генетика . 170 (1): 19–31. DOI : 10.1534 / genetics.104.034488 . PMC 1449705 . PMID 15687276 .  
  8. ^ Dykhuizen DE, Дин AM (2004). «Эволюция специалистов в экспериментальном микромире» . Генетика . 167 (4): 2015–26. DOI : 10.1534 / genetics.103.025205 . PMC 1470984 . PMID 15342537 .  
  9. ^ Вика Л. М., Weilenmann Н, Эк Т (2002). «Кажущаяся часовая эволюция Escherichia coli в хемостатах с ограничением глюкозы воспроизводима в целом, но не при малых размерах популяции и может быть объяснена с помощью кинетики Монода» . Микробиология . 148 (Pt 9): 2889–902. DOI : 10.1099 / 00221287-148-9-2889 . PMID 12213934 . 
  10. ^ Джонс LE, Ellner SP (2007). «Влияние быстрой эволюции добычи на циклы хищник-жертва». J Math Biol . 55 (4): 541–73. arXiv : q-bio / 0609032 . DOI : 10.1007 / s00285-007-0094-6 . PMID 17483952 . 
  11. ^ Schlegel HG, Jannasch HW (1967). «Обогащение культур». Анну. Rev. Microbiol . 21 : 49–70. DOI : 10.1146 / annurev.mi.21.100167.000405 . PMID 4860267 . 
  12. ^ Варма, А .; Палссон, Б.О. (1994-10-01). «Модели стехиометрического баланса потока количественно предсказывают рост и секрецию побочных продуктов метаболизма у Escherichia coli W3110 дикого типа» . Прикладная и экологическая микробиология . 60 (10): 3724–3731. ISSN 0099-2240 . ЧВК 2018 79 . PMID 7986045 .   
  13. ^ a b Фернандес-де-Коссио-Диас, Хорхе; Леон, Калет; Мулет, Роберто (2017-11-13). «Характеристика устойчивых состояний метаболических сетей в масштабе генома в непрерывных клеточных культурах» . PLOS Вычислительная биология . 13 (11): e1005835. arXiv : 1705.09708 . Bibcode : 2017PLSCB..13E5835F . DOI : 10.1371 / journal.pcbi.1005835 . ISSN 1553-7358 . PMC 5703580 . PMID 29131817 .   
  14. ^ Daughton CG, Шей DP (1977). «Утилизация паратиона бактериальными симбионтами в хемостате» . Appl. Environ. Microbiol . 34 (2): 175–84. PMC 242618 . PMID 410368 .  
  15. Перейти ↑ Pfeiffer T, Bonhoeffer S (2004). «Эволюция перекрестного кормления в микробных популяциях». Являюсь. Nat . 163 (6): E126–35. DOI : 10.1086 / 383593 . PMID 15266392 . 
  16. ↑ Дж. Дж. Батлер; GSK Wolkowicz (июль 1986 г.). «Опосредованная хищниками конкуренция в хемостате». J Math Biol . 24 (2): 67–191. DOI : 10.1007 / BF00275997 .
  17. ^ Dykhuizen DE, Hartl DL (июнь 1983). «Селекция в хемостатах» . Microbiol. Ред . 47 (2): 150–68. PMC 281569 . PMID 6308409 .  
  18. ^ Dykhuizen DE, Hartl DL (май 1981). «Эволюция конкурентоспособности Escherichia coli». Эволюция . 35 (3): 581–94. DOI : 10.2307 / 2408204 . JSTOR 2408204 . 
  19. ^ Bonomi A, Фредриксон AG (1976). «Питание простейших и рост бактериальной стенки». Biotechnol. Bioeng. 18 (2): 239–52. DOI : 10.1002 / bit.260180209 . PMID 1267931 .  
  20. ^ Де Crécy E, D, Metzgar Allen C, M, Pénicaud Lyons B, Hansen CJ, де Креси-Лагард V (2007). «Разработка нового устройства непрерывного культивирования для экспериментальной эволюции бактериальных популяций». Appl. Microbiol. Biotechnol. 77 (2): 489–96. DOI : 10.1007 / s00253-007-1168-5 . PMID 17896105 .  
  21. ^ Zhang Z, Boccazzi P, Choi HG, Perozziello G, Sinskey AJ, Йенсен К. Ф. (2006). «Микрохемостат-микробная непрерывная культура в инструментальном микробиореакторе на полимерной основе». Лабораторный чип . 6 (7): 906–13. DOI : 10.1039 / b518396k . PMID 16804595 . 
  22. ^ Ван Hulle SW, Ван Ден Брок S, Мартенс J, K Вилла, Schelstraete G, Volcke EI, Vanrolleghem PA (2003). «Практический опыт запуска и эксплуатации лабораторного реактора SHARON с непрерывной аэрацией». Commun. Agric. Appl. Биол. Sci. 68 (2 Pt A): 77–84. PMID 15296140 .  
  23. ^ а б в г д Wides A, Milo R (2018). «Понимание динамики и оптимизация производительности экспериментов по выбору хемостата». arXiv : 1806.00272 [ q-bio.PE ].

Внешние ссылки [ править ]

  1. http://www.pererikstrandberg.se/examensarbete/chemostat.pdf
  2. https://web.archive.org/web/20060504172359/http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/Contin/chemosta.htm
  3. Заключительная диссертация, включающая математические модели хемостата и других биореакторов.
  4. Страница об одной конструкции лабораторного хемостата
  5. Подробное руководство по хемостату (лаборатория Данхэма). Процедуры и принципы являются общими.