Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Снимок экрана приложения CaspLab Comet Assay

Анализ одноклеточного гель-электрофореза ( SCGE , также известный как анализ комет ) - несложный и чувствительный метод обнаружения повреждений ДНК на уровне отдельной эукариотической клетки . Впервые он был разработан Östling & Johansson в 1984 году, а затем модифицирован Сингхом и др. в 1988 году. [1]С тех пор он стал популярным как стандартный метод оценки повреждений / репарации ДНК, биомониторинга и тестирования генотоксичности. Он включает инкапсуляцию клеток в суспензию агарозы с низкой температурой плавления, лизис клеток в нейтральных или щелочных (pH> 13) условиях и электрофорез суспендированных лизированных клеток. Термин «комета» относится к модели миграции ДНК через гель для электрофореза, которая часто напоминает комету. [2] [3]

Кометный анализ (одноклеточный гель-электрофорез) - это простой метод измерения разрывов цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в эукариотических клетках. Клетки, внедренные в агарозу на предметном стекле микроскопа, лизируют детергентом и высоким содержанием соли с образованием нуклеоидов, содержащих суперскрученные петли ДНК, связанные с ядерным матриксом. Электрофорез при высоких значениях pH приводит к образованию структур, напоминающих кометы, которые наблюдаются с помощью флуоресцентной микроскопии; Интенсивность кометного хвоста относительно головы отражает количество разрывов ДНК. Вероятно, причиной этого является то, что петли, содержащие разрыв, теряют свою сверхспиральность и могут свободно расширяться к аноду. Затем следует визуальный анализ с окрашиванием ДНК и вычислением флуоресценции для определения степени повреждения ДНК. Это может быть выполнено вручную или автоматически с помощью программного обеспечения для обработки изображений.[4] [5]

Процедура [ править ]

Инкапсуляция [ править ]

Образец клеток, либо получены из ин витро культуры клеток или из в естественных условиях тестируемого субъекта диспергируют в отдельные клетки и суспендируют в расплавленной низкой температурой плавления агарозы при 37 ° C. Эта моновзвесь отливается на предметное стекло микроскопа . Стеклянная крышка скольжение удерживается под углом , и моно-подвеска применяется к точке контакта между покровным и ползуном. Когда покровное стекло опускается на предметное стекло, расплавленная агароза растекается, образуя тонкий слой. Агароза превращается в гель при 4 ° C и покровное стекло удаляется.

Агароза образует матрицу углеводных волокон, которые инкапсулируют клетки, закрепляя их на месте. Агароза считается осмотически нейтральной, поэтому растворы могут проникать в гель и воздействовать на клетки без изменения положения клеток.

В исследовании in vitro клетки будут подвергаться воздействию тестируемого агента - обычно ультрафиолетового света , ионизирующего излучения или генотоксичного химического вещества - чтобы вызвать повреждение ДНК в инкапсулированных клетках. Для калибровки , пероксид водорода , как правило , используется для обеспечения стандартизованного уровня повреждения ДНК.

Лисис [ править ]

Затем слайды погружают в раствор, который вызывает лизирование клеток . Раствор для лизиса, часто используемый в анализе комет, состоит из высококонцентрированной водной соли (часто может использоваться обычная поваренная соль ) и детергента (такого как Triton X-100 или саркозинат ). РН раствора для лизиса можно регулировать (обычно между нейтральной и щелочной рН) , в зависимости от типа повреждения исследователь исследует.

Водная соль разрушает белки и их структуру связывания в клетке, а также нарушает содержание РНК в клетке. Моющее средство растворяет клеточные мембраны . Под действием лизирующего раствора клетки разрушаются. Все белки, РНК, мембраны, цитоплазматические и нуклеоплазматические составляющие разрушаются и диффундируют в матрикс агарозы. Остается только ДНК клетки, которая распадается, заполняя полость в агарозе, которую прежде заполняла вся клетка. Эта структура называется нуклеоидом (общий термин для структуры, в которой сосредоточена ДНК).

Электрофорез [ править ]

После лизиса клеток (обычно 1-2 часа при 4 ° C) предметные стекла промывают дистиллированной водой для удаления всех солей и погружают во второй раствор - раствор для электрофореза . Опять же, этот раствор можно регулировать pH в зависимости от типа исследуемого повреждения.

Слайды оставляют на ~ 20 минут в растворе для электрофореза перед приложением электрического поля . В щелочных условиях двойной спирали ДНК является денатурированный и нуклеоидом становится одноцепочечной.

Применяется электрическое поле (обычно 1 В / см ) в течение ~ 20 минут. Затем слайды нейтрализуют до pH 7, окрашивают ДНК-специфическим флуоресцентным красителем и анализируют с помощью микроскопа с подключенной ПЗС-матрицей ( устройство с зарядовой связью - по сути, цифровой камерой ), подключенной к компьютеру с программным обеспечением для анализа изображений .

Фон [ править ]

Концепция, лежащая в основе анализа SCGE, заключается в том, что неповрежденная ДНК сохраняет высокоорганизованную ассоциацию с матричными белками в ядре. При повреждении эта организация нарушается. Отдельные нити ДНК теряют свою компактную структуру и расслабляются, расширяясь из полости в агарозу. При приложении электрического поля ДНК, имеющая общий отрицательный заряд, притягивается к положительно заряженному аноду. Неповрежденные цепи ДНК слишком велики и не покидают полость, тогда как чем меньше размер фрагментов, тем дальше они могут двигаться за определенный период времени. Следовательно, количество ДНК, покидающей полость, является мерой степени повреждения ДНК в клетке.

Анализ изображений измеряет общую интенсивность флуоресценции всего нуклеоида и флуоресценцию мигрированной ДНК и сравнивает два сигнала. Чем сильнее сигнал от перемещенной ДНК, тем больше повреждений. Общая структура напоминает комету (отсюда «кометный анализ») с круглой головкой, соответствующей неповрежденной ДНК, которая остается в полости, и хвостом поврежденной ДНК. Чем ярче и длиннее хвост, тем выше уровень повреждений.

Кометный анализ - это универсальный метод обнаружения повреждений, который с корректировкой протокола может использоваться для количественной оценки наличия широкого спектра повреждений (повреждений), изменяющих ДНК. Обычно обнаруживаются разрывы одинарных и двойных нитей. Иногда утверждают [6] [7], что щелочные условия и полная денатурация ДНК необходимы для обнаружения разрывов одной нити. Однако это не так, как одно-, так и двухцепочечные разрывы также обнаруживаются в нейтральных условиях. [8] [9] [10] [11] Однако в щелочных условиях дополнительные структуры ДНК обнаруживаются как повреждение ДНК: AP-сайты (базовые сайты, в которых отсутствует пиримидин или пиримидин).пуриновый нуклеотид ) и участки, где происходит эксцизионная репарация . [12] [13]

Кометный анализ - чрезвычайно чувствительный анализ повреждений ДНК. С этой чувствительностью необходимо обращаться осторожно, поскольку она также уязвима для физических изменений, которые могут повлиять на воспроизводимость результатов. По сути, следует избегать всего, что может вызвать повреждение или денатурацию ДНК, за исключением исследуемых факторов. [14] Наиболее распространенной формой анализа является щелочная версия, хотя пока нет окончательного протокола щелочного анализа. Благодаря простой и недорогой настройке его можно использовать в условиях, когда недоступны более сложные анализы.

Приложения [ править ]

К ним относятся тестирование на генотоксичность, биомониторинг человека и молекулярная эпидемиология, экогенотоксикология, а также фундаментальные исследования повреждений и восстановления ДНК. [15]

Фрагментация ДНК сперматозоидов [ править ]

Кометный анализ может определить степень фрагментации ДНК в сперматозоидах. Степень фрагментации ДНК была связана с результатами экстракорпорального оплодотворения . [16] [17]

Комета была модифицирована для использования со сперматозоидами в качестве инструмента диагностики мужского бесплодия [18] [19] [20]

Чтобы расщепить эти прочно связанные белки протамина, чтобы использовать комету для спермы, требуются дополнительные шаги в протоколе деконденсации. [19]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Сингх, Нарендра П .; Маккой, Майкл Т .; Тайс, Раймонд Р .; Шнайдер, Эдвард Л. (1988-03-01). «Простая техника для количественного определения низкого уровня повреждений ДНК в отдельных клетках» . Экспериментальные исследования клеток . 175 (1): 184–191. DOI : 10.1016 / 0014-4827 (88) 90265-0 . ISSN  0014-4827 .
  2. ^ Тайс, RR (2000). «Анализ одноклеточного геля / кометы: Руководство по генетическому токсикологическому тестированию in vitro и in vivo» . Экологический и молекулярный мутагенез . 35 (3): 206–21. DOI : 10.1002 / (SICI) 1098-2280 (2000) 35: 3 <206 :: AID-EM8> 3.0.CO; 2-J . PMID 10737956 . 
  3. ^ Nandhakumar, S; Парасураман, S; Шанмугам, ММ; Рао, КР; Чанд, П; Бхат, Б.В. (2011). «Оценка повреждения ДНК с помощью электрофореза в геле одной клетки (анализ комет)» . J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. DOI : 10.4103 / 0976-500X.81903 . PMC 3127337 . PMID 21772771 .  
  4. Перейти ↑ Collins, AR (март 2004 г.). «Кометный тест на повреждение и восстановление ДНК: принципы, применения и ограничения» . Мол. Biotechnol . 26 (3): 249–61. DOI : 10.1385 / MB: 26: 3: 249 . PMID 15004294 . S2CID 34355649 .  
  5. ^ Nandhakumar, S; Парасураман, S; Шанмугам, ММ; Рао, КР; Чанд, П; Bhat, BV (апрель 2011 г.). «Оценка повреждения ДНК с помощью электрофореза в геле одной клетки (анализ комет)» . J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. DOI : 10.4103 / 0976-500X.81903 . PMC 3127337 . PMID 21772771 .  
  6. ^ Пу, Синьчжу; Ван, Цзэминь; Клауниг, Джеймс Э. (2015-08-06). «Щелочной анализ комет для оценки повреждения ДНК в отдельных клетках». Текущие протоколы в токсикологии . 65 : 3.12.1–11. DOI : 10.1002 / 0471140856.tx0312s65 . ISBN 978-0471140856. ISSN  1934-9262 . PMID  26250399 . S2CID  6105193 .
  7. ↑ Мёллер, Питер (апрель 2006 г.). «Щелочной анализ комет: к валидации в биомониторинге воздействия ДНК, повреждающего» . Фундаментальная и клиническая фармакология и токсикология . 98 (4): 336–345. DOI : 10.1111 / j.1742-7843.2006.pto_167.x . ISSN 1742-7835 . PMID 16623855 .  
  8. ^ Беляев Игорь Юрьевич; Эрикссон, Стефан; Нигрен, Йонас; Торудд, Джеспер; Хармс-Рингдал, Матс (5 августа 1999 г.). «Влияние бромистого этидия на организацию петли ДНК в лимфоцитах человека, измеренное с помощью зависимости аномальной вязкости от времени и электрофореза в геле одной клетки». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Общие предметы . 1428 (2–3): 348–356. DOI : 10.1016 / S0304-4165 (99) 00076-8 . ISSN 0304-4165 . PMID 10434054 .  
  9. ^ Olive, PL; Banáth, JP; Дюран, Р. Э. (апрель 1990 г.). «Неоднородность в радиационно-индуцированном повреждении и восстановлении ДНК в опухолевых и нормальных клетках, измеренная с помощью« кометного »анализа». Радиационные исследования . 122 (1): 86–94. Bibcode : 1990RadR..122 ... 86O . DOI : 10.2307 / 3577587 . ISSN 0033-7587 . JSTOR 3577587 . PMID 2320728 .   
  10. ^ Powell, S .; Макмиллан, TJ (1990-10-01). «Повреждение и восстановление ДНК после лечения ионизирующим излучением» . Лучевая терапия и онкология . 19 (2): 95–108. DOI : 10.1016 / 0167-8140 (90) 90123-E . ISSN 0167-8140 . PMID 2255771 .  
  11. ↑ Wojewódzka, Мария; Бурачевска, Ивона; Крушевский, Марцин (27.06.2002). «Модифицированный анализ нейтральной кометы: устранение лизиса при высокой температуре и подтверждение анализа с использованием антител к одноцепочечной ДНК». Мутационные исследования . 518 (1): 9–20. DOI : 10.1016 / s1383-5718 (02) 00070-0 . ISSN 0027-5107 . PMID 12063063 .  
  12. ^ Коллинз, Эндрю Р. (1997-04-29). «Кометный анализ: что он может нам сказать?». Мутационные исследования / Фундаментальные и молекулярные механизмы мутагенеза . 375 (2): 183–193. DOI : 10.1016 / S0027-5107 (97) 00013-4 . ISSN 0027-5107 . PMID 9202728 .  
  13. ^ Гедик, CM; Ewen, SW; Коллинз, АР (сентябрь 1992 г.). «Одноячеечный гель-электрофорез применяется для анализа повреждений УФ-С и его восстановления в клетках человека». Международный журнал радиационной биологии . 62 (3): 313–320. DOI : 10.1080 / 09553009214552161 . ISSN 0955-3002 . PMID 1356133 .  
  14. ^ Теоретические и практические ограничения анализа обсуждаются, например, в Klaude et al. (1996) и Collins et al. (1997).
  15. ^ https://www2.le.ac.uk/departments/csmm/.../SCG%20Electrophoresis.pdf [ постоянная мертвая ссылка ]
  16. ^ Саймон L, Брунборг G, Стивенсон M, Lutton D, McManus J, Льюис SE (май 2010). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в результате вспомогательной репродукции» . Hum Reprod . 25 (7): 1594–1608. DOI : 10.1093 / humrep / deq103 . PMID 20447937 . 
  17. ^ Nagrajappa; Гангули, Анутош; Госвами, Уша (2006). «Повреждение ДНК в мужских половых клетках зеленой мидии (Perna viridis) при воздействии табачных изделий». Экотоксикология . 15 (4): 365–369. DOI : 10.1007 / s10646-006-0077-1 . PMID 16673160 . S2CID 13956778 .  
  18. ^ Hughes CM, Lewis SEM, McKelvey-Martin V, Thompson W. Воспроизводимость измерений ДНК сперматозоидов человека с использованием анализа электрофореза в геле одной клетки. Исследование мутаций 1997 374: 261-268.
  19. ^ а б Доннелли, штат ET; McClure, N; Льюис, SEM (1999). «Влияние добавок аскорбата и β-токоферола in vitro на целостность ДНК и вызванное перекисью водорода повреждение ДНК в сперматозоидах человека» . Мутагенез . 14 (5): 505–511. DOI : 10.1093 / mutage / 14.5.505 . PMID 10473655 . 
  20. ^ Рибас-Майноу Хорди, Агустин Гарсиа-Пейро, Альба Фернандес-Энсинас, Мария Хосе Аменгуаль и Бенет Хорди, двухцепочечные разрывы ДНК сперматозоидов, измеренные с помощью анализа комет, связаны с необъяснимым повторным выкидышем в парах без Женский фактор

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Дхаван и Андерсон (2009): Анализ комет в токсикологии. DOI : 10.1039 / 9781847559746
  • Авишай, Нантаван; Рабиновиц, Клодетт; Моисеева, Елизавета; Ринкевич, Барух (2002). «Генотоксичность реки Кишон, Израиль: применение клеточного анализа in vitro ». Мутационные исследования . 518 (1): 21–37. DOI : 10.1016 / S1383-5718 (02) 00069-4 . PMID  12063064 .
  • Коллинз, АР; Добсон, ВЛ; Дусинская, М .; Kennedy, G .; Стетина, Р. (1997). «Кометный анализ: что он может нам сказать?». Мутационные исследования . 375 (2): 183–193. DOI : 10.1016 / S0027-5107 (97) 00013-4 . PMID  9202728 .
  • Klaude, M .; Eriksson, S .; Nygren, J .; Анстром, Г. (1996). «Кометный тест: механизмы и технические соображения». Мутационные исследования . 363 (2): 89–96. DOI : 10.1016 / 0921-8777 (95) 00063-1 . PMID  8676929 .
  • Маккелви-Мартин, Валери Дж .; Хо, Эдвин Т .; Маккеун, Стефани Р .; Джонстон, С. Робин; Маккарти, Пэтси Дж .; Раджаб, Нор Фасила; Даунс, К. Стивен (1993). «Новые применения анализа одноклеточного гель-электрофореза (Комета). I. Лечение инвазивной переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря человека. II. Флуоресцентные кометы гибридизации in situ для идентификации поврежденных и восстановленных последовательностей ДНК в отдельных клетках» . Мутагенез . 13 (1): 1–8. DOI : 10.1093 / mutage / 13.1.1 . PMID  9491387 .
  • Olive, PL; Wlodek, D .; Банат, JP (1991). «Двухцепочечные разрывы ДНК, измеренные в отдельных клетках, подвергнутых гель-электрофорезу» (PDF) . Исследования рака . 51 (17): 4671–4676. PMID  1873812 .
  • Rojas, E .; Лопес, MC; Вальверде, М. (1999). «Электрофорез в одноклеточном геле: методология и применение». Журнал хроматографии B . 722 (1-2): 225–254. DOI : 10.1016 / S0378-4347 (98) 00313-2 . PMID  10068143 .
  • Сингх, Н. П.; Маккой, MT; Тайс, RR; Шнайдер, Э.Л. (1988). «Простая техника для количественного определения низкого уровня повреждений ДНК в отдельных клетках» . Экспериментальные исследования клеток . 175 (1): 184–191. DOI : 10.1016 / 0014-4827 (88) 90265-0 . PMID  3345800 .
  • Тайс, RR; Agurell, E .; Андерсон, Д .; Burlinson, B .; Hartmann, A .; Кобаяши, H .; Miyamae, Y .; Rojas, E .; Ryu, J.-C .; Сасаки, Ю. Ф. (2000). «Анализ одноклеточного геля / кометы: Руководство по генетическому токсикологическому тестированию in vitro и in vivo» . Экологический и молекулярный мутагенез . 35 (3): 206–221. DOI : 10.1002 / (SICI) 1098-2280 (2000) 35: 3 <206 :: AID-EM8> 3.0.CO; 2-J . PMID  10737956 .