Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Условный нокаут гена - это метод, используемый для устранения определенного гена в определенной ткани, например в печени. [1] [2] Этот метод полезен для изучения роли отдельных генов в живых организмах. Он отличается от традиционного нокаута гена, потому что он нацелен на определенные гены в определенное время, а не удаляется с начала жизни. Использование техники условного нокаута гена устраняет многие побочные эффекты традиционного нокаута гена . При традиционном нокауте гена гибель эмбриона в результате мутации генаможет произойти, и это мешает ученым изучать ген у взрослых. Некоторые ткани не могут быть изучены должным образом изолированно, поэтому ген должен быть неактивным в одной ткани, оставаясь активным в других. С помощью этой технологии ученые могут нокаутировать гены на определенной стадии развития и изучать, как нокаут гена в одной ткани влияет на тот же ген в других тканях. [3] [4]

Техника [ править ]

Схема, показывающая, как создать мышь с условным нокаутом: мышь, содержащую ген Cre, и мышь, содержащую ген lox, были скрещены для получения условного нокаута для конкретного представляющего интерес гена. Мыши в природе не экспрессируют Cre-рекомбиназу или сайты lox, но они были сконструированы для экспрессии этих генных продуктов для создания желаемого потомства.

Чаще всего используется метод рекомбинации Cre-lox. Фермент Cre-рекомбиназа специфически распознает два lox (локуса рекомбинации) в ДНК и вызывает рекомбинацию между ними. Во время рекомбинации две нити ДНК обмениваются информацией. Эта рекомбинация вызовет делецию или инверсию генов между двумя сайтами lox, в зависимости от их ориентации. Чтобы деактивировать ген, можно удалить весь ген. [1] [3] Вся эта система является индуцируемой, поэтому можно добавить химическое вещество, чтобы выключить гены в определенное время. Двумя наиболее часто используемыми химическими веществами являются тетрациклин, который активирует транскрипцию гена рекомбиназы Cre, и тамоксифен, который активирует транспорт белка рекомбиназы Cre к ядру. [4]Только несколько типов клеток экспрессируют Cre-рекомбиназу, и никакие клетки млекопитающих не экспрессируют ее, поэтому нет риска случайной активации lox-сайтов при использовании условного нокаута гена у млекопитающих. Выяснение того, как экспрессировать Cre-рекомбиназу в организме, обычно является самой сложной частью этого метода. [3]

Использует [ редактировать ]

Метод условного нокаута гена часто используется для моделирования заболеваний человека у других млекопитающих. [2] Это повысило способность ученых изучать болезни, такие как рак, которые развиваются в определенных типах клеток или на стадиях развития. [4] Известно, что мутации в гене BRCA1 связаны с раком груди. Ученые использовали условный нокаут гена для удаления аллеля BRCA1 в ткани молочной железы у мышей и обнаружили, что он играет важную роль в подавлении опухоли. [3]

Специфический ген в мозге мышей, который, как предполагалось, участвовал в возникновении болезни Альцгеймера, который кодирует фермент циклин-зависимую киназу 5 (Cdk5), был отключен. Было обнаружено, что такие мыши «умнее» обычных мышей и способны справляться со сложными задачами более разумно по сравнению с «нормальными» мышами, выведенными в лаборатории. [5]

Knockout Mouse Project (KOMP) [ править ]

Условные нокауты генов у мышей часто используются для изучения болезней человека, потому что многие гены производят сходные фенотипы у обоих видов. В течение последних 100 лет для этого использовалась генетика лабораторных мышей, потому что мыши - это млекопитающие, которые физиологически достаточно похожи на людей, чтобы проводить качественные исследования. Эти двое имеют настолько похожие гены, что из 4000 изученных генов только 10 были обнаружены у одного вида, но не у другого. Все млекопитающие имели одного общего предка примерно 80 миллионов лет назад; технически говоря, все геномы млекопитающих сравнительно похожи. Однако при сравнении мышей и людей их кодирующие белки участки геномов идентичны на 85% и имеют сходство между 99% их гомологов. Эти сходства приводят к выражению сходных фенотипов между двумя видами.[8] [12] Их гены очень похожи на человеческие, причем 99% гомологов похожи. Наряду с производством сходных фенотипов, они также являются очень многообещающими кандидатами для условного нокаута генов. [8] Цель KOMP - создать нокаутные мутации в эмбриональных стволовых клетках для каждого из 20 000 генов, кодирующих белок, у мышей.[2]Гены выбиты, потому что это лучший способ изучить их функции и узнать больше об их роли в болезнях человека. Существуют две основные стратегии условного нокаута гена: нацеливание на гены или гомологичная рекомбинация и улавливание гена. Оба метода обычно используют модифицированный вирусный вектор или линейный фрагмент в качестве способа транспортировки искусственной ДНК в ES-клетку-мишень. Затем клетки растут в чашке Петри в течение нескольких дней и вставляются в зародыши на ранней стадии. Наконец, эмбрионы помещаются в матку взрослой самки, где она может вырасти в свое потомство [9]. Некоторые аллели в этом проекте не могут быть выбиты традиционными методами и требуют специфичности техники условного нокаута гена. Для нокаута последних оставшихся аллелей необходимы другие комбинаторные методы.Условный нокаут гена - процедура, требующая много времени, и существуют дополнительные проекты, направленные на нокаут оставшихся генов мыши.[6] Участник проекта KOMP, Оливер Смитис, возможно, внес наибольший научный вклад в нацеливание на этот ген. Оливер получил Нобелевскую премию по медицине за метод, позволяющий определять функции в генах, и как использовать метод «нокаута» для удаления определенных генов. К сожалению, пионер в области генного таргетинга умер 10 января 2017 года в возрасте 91 года. [11] Проект КОМП был начат в 2006 году и продолжается до сих пор. [7] Репозиторий КОМП стимулирует участников проектов возвращать им отзывы, а тем, кто соответствует определенным критериям, может быть возмещено 50% стоимости их исследовательских ячеек. [10]

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б Варшней, Гуарав; Берджесс, Шон (26 октября 2013 г.). «Ресурсы мутагенеза и фенотипирования у рыбок данио для изучения развития и болезней человека» . Брифинги по функциональной геномике . 13 (2): 82–94. DOI : 10.1093 / bfgp / elt042 . PMC  3954039 . PMID  24162064 .
  2. ^ a b c Скарнес, Уильям; Розен, Барри; и другие. (2011). «Ресурс с условным нокаутом для полногеномного исследования функции генов мыши» . Природа . 474 (7351): 337–342. DOI : 10,1038 / природа10163 . PMC 3572410 . PMID 21677750 .  
  3. ^ a b c d Кларк, Алан (21 марта 2000 г.). «Манипулирование зародышевой линией: его влияние на изучение канцерогенеза» . Канцерогенез . 21 (3): 435–441. DOI : 10.1093 / carcin / 21.3.435 . PMID 10688863 . 
  4. ^ a b c Чжан, Цзянь; Чжао, Цзин (июль 2012 г.). «Условные генные манипуляции: создание новой биологической эры» . J Zhejiang Univ Sci Б . 13 (7): 511–524. DOI : 10,1631 / jzus.b1200042 . PMC 3390709 . PMID 22761243 .  
  5. ^ «Повышенный интеллект с помощью генной инженерии» . 2007-05-29 . Проверено 30 мая 2015 .
  6. ^ Гуань, Чуньмэй; Е, Чао; Ян, Сяомэй; Гао, Цзянган (2010). "Обзор текущих крупномасштабных попыток нокаута мыши". Бытие . 48 (2): 73–85. DOI : 10.1002 / dvg.20594 . PMID 20095055 . S2CID 34470273 .  
  7. ^ Гондо, Y (2008). «Тенденции крупномасштабного мутагенеза мышей: от генетики к функциональной геномике» . Nat. Преподобный Жене . 9 (10): 803–810. DOI : 10.1038 / nrg2431 . PMID 18781157 . Дата обращения 5 ноября 2015 . 

8. Остин, С. П., Бэтти, Дж. Ф., Брэдли, А., Букан, М., Капеччи, М., Коллинз, Ф. С., Дав, В. Ф., Дайк, Г., Даймеки, С., Эппиг, Д. Т., Гридер, Ф. Б. , Хайнц, Н., Хикс, Г., Инсел, Т. Р., Джойнер, А., Коллер, Б. Х., Ллойд, К. К., Магнусон, Т., Мур, М. В., Надь, А.,… Замбрович, Б. (2004) . Проект мыши с нокаутом. Генетика природы, 36 (9), 921–924. https://doi.org/10.1038/ng0904-921

9. Информационный бюллетень о мышах-нокаутах. (nd). Получено с https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet.

10. Ллойд К.С. (2011). Ресурс о мышах для биомедицинских исследователей. Анналы Нью-Йоркской академии наук, 1245, 24–26. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.06311.x

11. Лауреат Нобелевской премии д-р Оливер Смитис прочтет лекцию графа Х. Морриса 10 июля. (Nd). Получено с https://medicine.wright.edu/about/article/2009/smithieslecture.

12. NIH. (nd). Почему мышь имеет значение. Получено с https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome.