Криогенная электронная микроскопия

Криогенная электронная микроскопия ( крио-ЭМ ) - это метод электронной микроскопии (ЭМ), применяемый к образцам, охлажденным до криогенных температур и погруженным в среду стекловидной воды . Водный раствор образца наносят на сетку и погружают в жидкий этан или смесь жидкого этана и пропана. [2] Хотя разработка метода началась в 1970-х годах, недавние достижения в технологии детекторов и программных алгоритмах позволили определять биомолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [3] Это привлекло широкое внимание к подходу в качестве альтернативы рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии. для определения структуры макромолекул без необходимости кристаллизации.

Просвечивающий электронный микроскоп (2015).
Криоэлектронная микрофотография гигантского морского вируса CroV
(масштабная линейка составляет 200 нм) [1]

В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворах с высоким разрешением». [4] Nature Methods также назвала крио-ЭМ «методом года» в 2016 году. [5]

Криогенная просвечивающая электронная микроскопия (крио-ТЕМ) - это метод просвечивающей электронной микроскопии , который используется в структурной биологии и материаловедении .

  • Изображение интактной клетки ARMAN из биопленки Iron Mountain, полученное методом криогенной просвечивающей электронной микроскопии (cryoTEM). Ширина изображения 576 нм.

    • Ранняя разработка

    В 1960-х годах использование просвечивающей электронной микроскопии для методов определения структуры было ограничено из-за радиационных повреждений, вызванных пучками электронов высокой энергии. Ученые предположили, что изучение образцов при низких температурах уменьшит радиационные повреждения, вызванные пучком. [11] И жидкий гелий (-269 ° C, или 4 K, или -452,2 ° F ), и жидкий азот (-195,79 ° C, или 77 K, или -320 ° F ) считались криогенами. В 1980 году Эрвин Кнапек и Жак Дюбоше опубликовали комментарии о повреждении луча при криогенных температурах, поделившись наблюдениями, которые:

    Было обнаружено, что тонкие кристаллы, закрепленные на углеродной пленке, в 30-300 раз более устойчивы к пучку при 4 К, чем при комнатной температуре ... Большинство наших результатов можно объяснить, если предположить, что криозащита в области 4 К сильно зависит от температура. [12]

    Однако эти результаты не удалось воспроизвести, и всего два года спустя в журнале Nature были опубликованы поправки, в которых сообщалось, что сопротивление пучка оказалось менее значительным, чем предполагалось изначально. Защита, полученная при 4 К, была ближе к «десятикратной для стандартных образцов L-валина» [13], чем было заявлено ранее.

    В 1981 году ученые Европейской лаборатории молекулярной биологии Аласдер МакДауэлл и Жак Дюбоше сообщили о первом успешном применении крио-ЭМ. [14] Макдоуол и Dubochet остеклованы чистая вода в тонкой пленке путем распыления его на гидрофильную углеродную пленку , которая быстро погрузилась в криогенный (жидкий пропан или жидкий этан охлажденного до 77 К). Тонкий слой аморфного льда имел толщину менее 1 мкм, и электронограмма подтвердила присутствие аморфного / стекловидного льда. В 1984 году группа Дюбоше продемонстрировала силу крио-ЭМ в структурной биологии с анализом витрифицированного аденовируса типа 2, бактериофага Т4 , вируса леса Семлики , бактериофага CbK и вируса везикулярного стоматита . [15]

    Нобелевская премия по химии 2017 г.

    В 2017 году трое ученых, Жак Дюбоше , Иоахим Франк и Ричард Хендерсон , были удостоены Нобелевской премии по химии за разработку метода изображения биомолекул. [4]

    Потенциальный конкурент рентгеновской кристаллографии

    По состоянию на 27 октября 2020 года рентгеновская кристаллография использовалась для получения изображений 150 494 биологических образцов и является доминирующим методом в биологической микроскопии , крио-ЭМ далеко позади - всего 6016. [16]

    Однако, согласно Nature , достижения в области прямых электронных детекторов (часто называемых устройствами прямого обнаружения или DDD) в Кембриджском университете [17] и автоматизация производства образцов компанией SPT labtech [18] привели к увеличению использования биологические поля [19], что делает Крио-ЭМ потенциальным конкурентом.

    Разрешение рентгеновской кристаллографии ограничено чистотой кристаллов [20], и создание таких образцов занимает очень много времени, вплоть до месяцев или даже лет. [19] Кроме того, некоторые белки трудно кристаллизовать. [19] [21] Хотя подготовка образца для Крио-ЭМ все еще трудоемка, [22] у него нет этих проблем, поскольку он наблюдает образец в его «естественном состоянии». [21]

    Согласно Proteopedia , среднее разрешение, полученное с помощью рентгеновской кристаллографии (по состоянию на 19 мая 2019 г.) в банке данных о белках, составляет 2,05 Å [20], а максимальное разрешение, достигнутое за всю историю (по состоянию на 27 октября 2020 г.), составляет 0,48. Å. [23] По состоянию на 2020 год большинство белковых структур, определенных Cryo-EM, имеют более низкое разрешение - 3–4 Å. [24] Однако лучшее разрешение Cryo-EM приближается к 1,5 Å [25], что в некоторых случаях делает его достойным конкурентом по разрешению.

    В 2019 году корреляционный свет Cryo-TEM и Cryo-ET использовался для наблюдения туннельных нанотрубок (TNT) в нейрональных клетках. [26]

    Сканирующий электронный cryomicroscopy (cryoSEM) является методом сканирующей электронной микроскопии метод холодной стадии с помощью сканирующего электронного микроскопа в криогенной камере.

    • Криофиксация
    • Электронная томография (ЭТ)

    1. ^ Xiao, C., Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N., Avila, GA, и Suttle, CA (2017) «Крио-ЭМ реконструкция капсида вируса Cafeteria roenbergensis предлагает новый путь сборки гигантских вирусов. ". Научные доклады , 7 : 5484. DOI : 10.1038 / s41598-017-05824-ш .
    2. ^ Тивол, Уильям Ф .; Бригель, Ариана; Дженсен, Грант Дж. (Октябрь 2008 г.). «Улучшенный криоген для глубинного замораживания» . Микроскопия и микроанализ . 14 (5): 375–379. Bibcode : 2008MiMic..14..375T . DOI : 10.1017 / S1431927608080781 . ISSN  1431-9276 . PMC  3058946 . PMID  18793481 .
    3. ^ Cheng Y, Grigorieff N, Penczek PA, Walz T (апрель 2015 г.). «Праймер для криоэлектронной микроскопии одиночных частиц» . Cell . 161 (3): 438–449. DOI : 10.1016 / j.cell.2015.03.050 . PMC  4409659 . PMID  25910204 .
    4. ^ а б Кресси Д., Каллавей Э. (октябрь 2017 г.). «Криоэлектронная микроскопия приносит Нобелевскую премию по химии» . Природа . 550 (7675): 167. Bibcode : 2017Natur.550..167C . DOI : 10.1038 / nature.2017.22738 . PMID  29022937 .
    5. ^ Дорр, Эллисон (январь 2017 г.). «Криоэлектронная томография». Методы природы . 14 (1): 34. DOI : 10.1038 / nmeth.4115 . ISSN  1548-7091 . S2CID  27162203 .
    6. ^ Nannenga, Brent L; Ши, Дан; Лесли, Эндрю GW; Гонен, Тамир (2014-08-03). «Определение структуры с высоким разрешением путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Методы природы . 11 (9): 927–930. DOI : 10,1038 / Nmeth.3043 . PMC  4149488 . PMID  25086503 .
    7. ^ Джонс, Кристофер Дж .; Martynowycz, Michael W .; Хаттне, Йохан; Фултон, Тайлер Дж .; Штольц, Брайан М .; Родригес, Хосе А .; Nelson, Hosea M .; Гонен, Тамир (2018-11-02). «Метод криоЭМ MicroED как мощный инструмент для определения структуры малых молекул» . АСУ Центральная Наука . 4 (11): 1587–1592. DOI : 10.1021 / acscentsci.8b00760 . PMC  6276044 . PMID  30555912 .
    8. ^ де ла Крус, М. Джейсон; Хаттне, Йохан; Ши, Дан; Зайдлер, Пол; Родригес, Хосе; Рейес, Фрэнсис Э; Савая, Майкл Р.; Cascio, Duilio; Вайс, Саймон С (2017). «Структуры с атомным разрешением из фрагментированных кристаллов белка с помощью метода криоЭМ MicroED» . Методы природы . 14 (4): 399–402. DOI : 10.1038 / nmeth.4178 . PMC  5376236 . PMID  28192420 .
    9. ^ Gruene T, Wennmacher JT, Zaubitzer C, Holstein JJ, Heidler J, Fecteau-Lefebvre A, De Carlo S, Müller E, Goldie KN, Regeni I, Li T, Santiso-Quinones G, Steinfeld G, Handschin S, van Genderen E , ван Боховен JA, Clever GH, Pantelic R (октябрь 2018 г.). «Быстрое определение структуры микрокристаллических молекулярных соединений с помощью дифракции электронов» . Angewandte Chemie . 57 (50): 16313–16317. DOI : 10.1002 / anie.201811318 . PMC  6468266 . PMID  30325568 .
    10. ^ Чэн, Ифань (31.08.2018). «Одночастичная крио-ЭМ - как она попала сюда и куда пойдет» . Наука . 361 (6405): 876–880. Bibcode : 2018Sci ... 361..876C . DOI : 10.1126 / science.aat4346 . ISSN  0036-8075 . PMC  6460916 . PMID  30166484 .
    11. ^ Дубочет Дж., Кнапек Э. (апрель 2018 г.). «Взлеты и падения в ранней электронной криомикроскопии» . PLOS Биология . 16 (4): e2005550. DOI : 10.1371 / journal.pbio.2005550 . PMC  5929567 . PMID  29672565 .
    12. ^ Кнапек Э., Дубочет Дж. (Август 1980 г.). «Повреждение органического материала пучком значительно снижается при криоэлектронной микроскопии». Журнал молекулярной биологии . 141 (2): 147–61. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (80) 90382-4 . PMID  7441748 .
    13. ^ Ньюмарк П. (30 сентября 1982 г.). «Крио-трансмиссионная микроскопия Угасающие надежды» . Природа . 299 (5882): 386–387. Bibcode : 1982Natur.299..386N . DOI : 10.1038 / 299386c0 .
    14. ^ Dubochet, J .; McDowall, AW (декабрь 1981 г.). «Стеклование чистой воды для электронной микроскопии» . Журнал микроскопии . 124 (3): 3–4. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.1981.tb02483.x .
    15. ^ Адриан, Марк; Дюбоше, Жак; Лепо, Жан; Макдауэл, Аласдер У. (март 1984 г.). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–36. Bibcode : 1984Natur.308 ... 32A . DOI : 10.1038 / 308032a0 . ISSN  0028-0836 . PMID  6322001 . S2CID  4319199 .
    16. ^ «RCSB PDB - Holdings Report» . www.rcsb.org . Проверено 27 октября 2020 .
    17. ^ Каллавей, Юэн (10 сентября 2015 г.). «Революция не будет кристаллизоваться: новый метод пронизывает структурную биологию» . Новости природы . 525 (7568): 172–174. Bibcode : 2015Natur.525..172C . DOI : 10.1038 / 525172a . PMID  26354465 .
    18. ^ Бейкер, Моня (2018-09-25). «Криоэлектронная микроскопия наверху» . Природа . 561 (7724): 565–567. Bibcode : 2018Natur.561..565B . DOI : 10.1038 / d41586-018-06791-6 . PMID  30254359 .
    19. ^ а б в Каллавей, Юэн (2020-02-10). «Революционная крио-ЭМ захватывает структурную биологию» . Природа . 578 (7794): 201. Bibcode : 2020Natur.578..201C . DOI : 10.1038 / d41586-020-00341-9 . PMID  32047310 .
    20. ^ а б «Резолюция - протеопедия, жизнь в 3D» . proteopedia.org . Проверено 27 октября 2020 .
    21. ^ а б «Крио-ЭМ Сервисы - Креативная биоструктура» . www.creative-biostructure.com . Проверено 27 октября 2020 .
    22. ^ Бхелла, Дэвид (2019-08-01). «Криоэлектронная микроскопия: введение в методику и соображения при работе над созданием национального объекта» . Биофизические обзоры . 11 (4): 515–519. DOI : 10.1007 / s12551-019-00571-ш . ISSN  1867-2469 . PMC  6682334 . PMID  31359340 .
    23. ^ Банк, RCSB Protein Data. «RCSB PDB» . www.rcsb.org . Проверено 27 октября 2020 .
    24. ^ Ип, Ка Ман; Фишер, Нильс; Пакния, Эльхам; Чари, Ашвин; Старк, Хольгер (2020). «Определение структуры белка с атомным разрешением с помощью крио-ЭМ». Природа . 587 (7832): 157–161. Bibcode : 2020Natur.587..157Y . DOI : 10.1038 / s41586-020-2833-4 . PMID  33087927 .
    25. ^ Бхелла, Дэвид (2019-08-01). «Криоэлектронная микроскопия: введение в методику и соображения при работе над созданием национального объекта» . Биофизические обзоры . 11 (4): 515–519. DOI : 10.1007 / s12551-019-00571-ш . ISSN  1867-2469 . PMC  6682334 . PMID  31359340 .
    26. ^ Сартори-Рупп, Анна; Кордеро Сервантес, Диего; Пепе, Анна; Гуссе, Карин; Делаж, Элиза; Корройер-Дульмон, Саймон; Шмитт, Кристина; Крижнсе-Локер, Якомина; Зурзоло, Кьяра (декабрь 2019 г.). «Корреляционная криоэлектронная микроскопия выявляет структуру TNT в нейрональных клетках» . Nature Communications . 10 (1): 342. Bibcode : 2019NatCo..10..342S . DOI : 10.1038 / s41467-018-08178-7 . ISSN  2041-1723 . PMC  6341166 . PMID  30664666 .